РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Бозайниците живеят в сложна и до голяма степен симбиотична връзка с чревната си микробиота. Тази микробиота съдържа 150 пъти повече гени от гостоприемника и показва сложни взаимодействия с диетата на гостоприемника (1–3). При тревопасните бозайници разнообразните чревни бактерии ферментират диета с високо съдържание на непокорна целулоза и от своя страна синтезират хранителни вещества от храната във форма, по-податлива на усвояване от гостоприемника (4). Освен това тревопасните бозайници приютяват по-голямо микробно разнообразие в червата си от всеядните или месоядните (1). Въпреки напредъка на изследванията за взаимодействията между чревната микробиота на бозайниците и диетата, изолирането на специфични взаимодействия между диетите и микробите в такава сложна система се оказа трудно (5, 6).

ефект

Освен че имат роля във ферментацията, микробите играят важна роля в биотрансформацията на хранителните токсини при тревопасните бозайници (4, 7–10). За някои токсини, като оксалат или 3,4-дихидроксипиридин (DHP), един вид бактерии е способен да биотрансформира токсина и тази функция може да бъде прехвърлена на други бозайници чрез микробни трансплантации (7, 8, 11, 12) . За други токсини, като креозотна смола, трансплантацията на цяла микробна общност при други бозайници може да увеличи толерантността (10).

Дивото тревопасно бозайник Neotoma albigula (бяло гърлено дърво) е идеален вид за изследване на ефектите на диетичния оксалат. Някои популации от N. albigula консумират диета, съставена от почти 100% кактус от вида Opuntia, който съдържа високо съдържание на оксалат (1,5%, сухо тегло) (26). Neotoma albigula може да разгради> 90% от диетичния оксалат, когато се храни с изкуствени диети с до 9% оксалат (сухо тегло). Предполага се, че това високо ниво на разграждане на оксалатите е резултат от микробния метаболизъм (27, 28). Освен това, N. albigula съдържа разнообразие от известни и потенциално разграждащи оксалата бактерии, разпределени в стомашно-чревния тракт, включително Oxalobacter, Lactobacillus, Clostridium и Enterococcus, наред с други (26). По този начин N. albigula редовно консумира големи количества оксалат и съдържа разнообразие от бактерии, които проявяват сложни взаимодействия с оксалат, което го прави идеален вид за изясняване на взаимодействията оксалат-микробиота.

Целта на настоящото проучване беше да се идентифицират екологичните и функционални взаимодействия между диетичния оксалат и чревната микробиота на N. albigula. Това проучване има две основни цели. Първият е да се определи количествено ефектът от увеличаването на консумацията на оксалат върху разграждането на оксалатите in vivo. Второто е да се определи дали чревната микробиота на N. albigula проявява реакция на ниво общност към консумацията на оксалати. Предвид предварително идентифицираните диференциални отговори на разграждащите оксалат бактерии към присъствието на оксалат, ние прогнозирахме, че оксалатът ще стимулира растежа на някои микробни таксони и ще инхибира растежа на други, като същевременно има неутрален ефект върху останалата общност. Нашите данни подкрепят хипотезата, че специализирана микробна мрежа от бактерии е отговорна за разграждането на оксалатите в N. albigula .

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Местоположение, събиране и диета на животните. Шест бяло гърлени дървени плъхове (N. albigula) бяха събрани с живи капани на Шерман от Castle Valley, Юта (38.63 ° с.ш., 109.41 ° з.д.), през октомври 2012 г. Дървесните птици бяха незабавно транспортирани до Университета на Юта, Катедра по биология на животните Съоръжение и се помещава в отделни клетки (48 на 27 на 20 см) при 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина при 28°C и 20% влажност. Животните бяха държани в плен и хранени със заешки чау с високо съдържание на фибри с 0,2% оксалат (формула Teklad 2031; Harlan, Denver, CO, USA) в продължение на 6 месеца преди експериментиране. Всички методи са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) по протокол 12-12010.

Дизайн на диетата a

Оксалатни анализи. Количествено се определя оксалатът в урината, като се следва модифициран протокол, описан от Ingale et al. (30). Проби от урина се събират ежедневно от всяко животно за анализите и се събират за всеки период на лечение. Пробите от урина се подкисляват с 3 М HNO3 до рН от 2 стойности> 0,9.

За да оценим колко диетичен оксалат се разгражда, ние определихме количествено разликата между консумирания оксалат и общия екскретиран оксалат. Тази оценка е консервативна, като се има предвид, че някои ендогенно произведени оксалати, отделяни с урината и изпражненията, не се отчитат при този метод. Оценките ни за общата екскреция на оксалати при не-оксалатната диета обаче показват, че ендогенният принос обикновено е малък (Микробни инвентаризации. Събрахме пресни изпражнения за микробните инвентари в последния ден от всяко диетично лечение, които бяха замразени при -80 ° С до екстракция на ДНК. ДНК беше извлечена от 180 до 220 g изпражнения с помощта на миниатюра за изпражнения на QIAamp ДНК (Qiagen, Germantown, MD, USA). ДНК екстракции бяха извършени и върху оксалат, храна и реагентите на екстракционния комплект за идентифициране потенциални източници на замърсяване. Микробните инвентаризации от общо 36 фекални проби бяха генерирани чрез усилване на V4 региона на гена 16S rRNA с праймерите 515F и 806R (31). Праймерите съдържаха 12-базова последователност от баркодове, което позволяваше мултиплексиране на проби в рамките на еднолентово секвениране на Illumina MiSeq, със сдвоено крайно секвениране от 150 bp всяка, както е описано по-рано (32).

Последователностите бяха анализирани с помощта на QIIME (33). Проведен е стандартен контрол на качеството и последователностите са демултиплексирани, като се използват параметрите по подразбиране в QIIME. Използвана е стратегия за ново избиране за класифициране на оперативните таксономични единици (OTU) с UCLUST (34) с минимална идентичност на последователността от 97%. Тази стратегия доведе до OTU таблица и филогенетично дърво, които бяха използвани в анализи надолу по веригата. Последователностите, идентифицирани като хлоропласти или митохондрии или тези, които са имали по-малко от 10 представяния в набора от данни, бяха премахнати. Освен това, проби от микробни съобщества с по-малко от 3000 последователни отчитания бяха отстранени от по-нататъшния анализ на данните. За сравнителните анализи пробите бяха рарифицирани до същата дълбочина на вземане на проби от 27 378 отчитания, което беше най-големият брой, който включваше всички проби, останали след контрол на качеството.

Изчислихме показателите за разнообразие на α-разнообразие (индекс на богатството на Маргалеф), равномерност (равнопоставеност) и индекс на Шанън. Членството в общността и структурата са определени, като се използват съответно непретеглени и претеглени UniFrac анализи, за да се сравнят нивата на сходство на микробната общност при отделни индивиди и диетични лечения. Непретегленият анализ на UniFrac сравнява членовете на общността, докато претегленият анализ също взема предвид относителното изобилие (35). Сравненията бяха направени с анализ на сходството (ANOSIM) след 999 пермутации. Освен това е извършен анализ на корелацията на Pearson с повторно измерване между относителното изобилие на OTU и консумацията на оксалат за всички проби и OTU. Софтуерът с отворен код QIIME е използван за показатели за разнообразие, ANOSIM и корелация, с корекция на скоростта на фалшиво откриване (FDR) за корелацията на Пиърсън. Значимостта е определена при Р стойност на разграждането на оксалат. Телесната маса, приемът на храна, DMD, приема на вода и отделянето на урина не се различават значително при леченията (Таблица 2). Приемът на оксалат се увеличи значително с увеличаване на концентрациите на диетични оксалати (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Показатели, свързани с дървени плъхове, които не са били значително засегнати от оксалат a

Относително изобилие на основната фила, присъстваща в червата при различни диетични концентрации на оксалат във времето. Категорията „Друго“ съдържа няколко типа с незначителен принос към микробиотата. Колоните са подредени спрямо времевия ред на експеримента. Нито членството в общността, нито структурата се променят при лечение с оксалат (P = 0,496 или 0,691, съответно).

Показатели за α-разнообразие между различните лечения с диетични оксалати. Видовото богатство се определя с индекса на богатството на Маргалеф, равномерността на видовете се определя от тяхната равнопоставеност, а индексът на Шанън е комбинация от видово богатство и равномерност. Статистическите анализи бяха повторени ANOVA-мерки, последвани от Holm-коригиран сдвоен t тест. Същите букви показват статистически подобни групи за лечение. Редът на колоните отразява времевите редове на експеримента. (А) Видово богатство, демонстрирано чрез многократни мерки ANOVA [F (5, 30) = 2,67, P = 0,044]; (B) равномерност на видовете, както се демонстрира чрез многократни мерки ANOVA [F (5, 30) = 1,1126, P = 0,38]; (C) Индекс на Шанън, определен чрез многократно измерване ANOVA [F (5, 30) = 2,9928, P = 0,031].

Видовото богатство е свързано с консумацията на оксалат (повторно измерване на корелация на Пиърсън с Р от 0,001 и r от 0,529). Символите представляват средна консумация на оксалат и видово богатство за всяко третиране.

От 6 232 идентифицирани OTU, общо 116 OTU показват значителна положителна корелация (P Oxalobacter, друга Oxalobacteraceae sp., Clostridiales и Lachnospiraceae, между другото. Таксономичната клада с най-голям брой OTU, която показва положителна корелация е S24 -7 семейство.

Микробни OTU, чиито относителни количества са положително корелирани с приема на оксалат a

Подгрупа от идентифицирани OTU бяха споделени за всички животни и лечения. Общо 103 OTU присъстваха при всичките шест животни на диета без оксалати, а 282 OTU бяха споделени от животни на диета с 3% оксалат, включително всички, които присъстваха при всички животни на диета без оксалат (вж. Таблица S2 в допълнителния материал).

ДИСКУСИЯ

Настоящото проучване се стреми да отстрани две важни пропуски в изследванията на чревната микробиота. Първо, необходимо е да се разберат факторите, които допринасят за промените във формата и функцията на микробиотата на червата на бозайниците, както за подпомагане развитието на персонализирани терапии, така и за развитие на екологичните теории (5, 6). Изучаването на тези фактори обаче е объркано от сложността, присъща на чревната микробиота, с нейното огромно и променливо разнообразие и значителни взаимодействия между микроби и микроби и гостоприемници (2, 6, 36). Второ, необходимо е да се разбере как оксалатът влияе върху микробиотата на червата на бозайниците като цяло. Предишни изследвания са фокусирани върху ролята на отделните таксони при разграждането на оксалатите (7, 20, 29, 37, 38). Въпреки това, няколко оксалаторазграждащи таксона сега са идентифицирани от червата на бозайниците, а други таксони могат да бъдат засегнати от оксалат по неясни начини (20, 26, 39, 40). За да отстраним пропуските, комбинирахме контролирани лабораторни диетични проучвания, физиологични анализи и микробна екология, за да изследваме таксономичния и функционален отговор на цялата микробиота на червата при тревопасно животно от бозайник, N. albigula, което естествено консумира големи количества оксалат в диетата си, просто съединение, което се метаболизира изключително от чревната микробиота (18, 26).

Микробиотата на N. albigula е изключителна в способността си да разгражда оксалат. Животните не проявяват неблагоприятни ефекти, свързани с приема на оксалат (Таблица 1) и микробиотата е в състояние да разгради> 90% от диетичния оксалат, независимо от количеството консумиран оксалат, показвайки силен микробен отговор на консумацията на оксалат. Проучванията, проведени върху други бозайници, показват, че нивото на разграждане на диетичния оксалат в N. albigula е уникално (27, 28). Норвежкият плъх (Rattus norvegicus) става хипероксалуричен при 1,5% оксалатна диета (41; непубликувани данни), докато друго проучване показва, че N. albigula може да понася 9% оксалат без вреден ефект (27). Една потенциална морфологична характеристика, която може да улесни разграждането на оксалатите в N. albigula, е наличието на предни черва, в които се помещава микробиота с висок потенциал за разграждане на оксалатите (10, 26). В метаболитните клетки животните от N. albigula имат достъп до директна копрофагия (консумация на изпражнения от ануса), която може да помогне за инокулиране на предните черва с разграждащи оксалат бактерии. Предвид резултатите от настоящите и предишни проучвания, изглежда, че чревната микробиота на N. albigula има значителен капацитет за разграждане на оксалати, което показва бърз микробен отговор на консумацията на оксалат.

Нашата работа показва, че диетичният оксалат засяга както разнообразието на микробната общност като цяло в N. albigula, така и относителното изобилие на специфични OTU. Корелацията между консумацията на оксалат и богатството на видовете (Фиг. 3А) предполага, че OTU, които са присъствали под откриваемите граници при животните на диета без оксалат, са се увеличили относително в изобилие с по-висока консумация на оксалат до откриваеми нива. Подобна корелация между консумацията на (естествени) хранителни токсини и разнообразието на чревната микробиота е наблюдавана в други проучвания на Woodrat и вероятно е показател за динамична адаптация в общността към диетичните промени (42). Въпреки че в настоящото проучване имаше силен индивидуален подпис на чревната микробиота, някои OTU бяха широко разпределени сред животните като цяло и показаха значителна корелация с консумацията на оксалат (Таблица 3; вж. Също Таблица S2 в допълнителния материал). Подгрупата от микроби, която се е увеличила с консумацията на оксалати, може да представлява основна общност от микроби, необходими за функцията на разграждане на оксалатите, или „оксалатен микробиом“.

Основна чревна микробиота преди това е била свързана с различни фенотипи на гостоприемници при бозайници (43–45). В настоящото проучване ние идентифицирахме основен набор от бактерии, които обикновено се разпространяват между индивидите и реагират на оксалат, което предполага, че тази микробна мрежа може да бъде важна за намаляване на абсорбцията на оксалати в N. albigula. Някои от бактериите в тази група, като Oxalobacter, могат да участват в разграждането на оксалатите директно. Други, като Oscillospira и Clostridiales, могат непряко да се възползват от разграждането на оксалати, евентуално чрез ацетогенеза и да улеснят продължаващото присъствие на онези бактерии, които разграждат оксалата.

Стратегии за използване на известни разграждащи оксалат бактерии като пробиотични терапии за намаляване на отделянето на оксалат с урината при хора и модели на плъхове обикновено водят само до ефимерно намаляване на уринарния оксалат и преходна колонизация от пробиотичните бактерии (11, 37, 41, 46, 47) . Това е за разлика от бозайниците, които са естествени гостоприемници на разграждащи оксалат бактерии, като животните в настоящото проучване, които поддържат тези популации и свързаните с тях функции през поколенията и реагират на увеличаване на диетичния оксалат дори след дълги периоди от време без оксалат в диетата (38, 48, 49). Преходната колонизация на разграждащите оксалатите бактерии след пробиотично лечение предполага, че тези трансплантирани бактерии не са в състояние да се интегрират успешно в чужда общност, което предполага, че има основни механизми за подкрепа на тези бактерии в техните естествени гостоприемници.

Изглежда, че семейството S24-7 играе критична роля както в оксалатния микробиом, така и в чревната микробиота на N. albigula. Това семейство обхваща 43% от OTU, което показва значителна корелация с консумацията на оксалати и постоянно съставлява> 50% от цялата чревна микробиота в N. albigula (10; това проучване). Това семейство често се среща при плъхове, мишки, кози и хора и също е свързано с диета с високо съдържание на мазнини, имуноглобин А, тении и др. По този начин семейството S24-7 обикновено може да бъде чувствително към диетични промени (50– 54). Предвид широкото разпространение на това семейство и корелацията с редица хранителни компоненти, S24-7 представлява значителна пропаст в нашето разбиране за формата и функцията на чревната микробиота.

Оксалатът е просто молекулярно съединение с характеристики, които го правят податлив на изясняване на специфични взаимодействия между диета и микробиота в червата на бозайниците. В настоящото проучване успяхме да предскажем идентичността на подсъобщество от микроби, което показва силен, бърз отговор на поглъщането на оксалати. Нашите резултати показват, че съществува отделен метаболизиращ оксалат микробиом, който се увеличава в изобилие, когато се консумира оксалат. Освен това показахме, че използваните тук методи са ефективни при идентифициране на подсъобщества в микробиотата на червата на бозайниците, които участват в определена интересна функция и които могат да бъдат полезни за манипулиране в терапевтичен контекст.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на Кевин Кол за помощта при събирането на животни, Джеси Нелсън за помощта при диетични изпитания и Ky-Phuong Luong за коментари по ръкописа. Благодарим на Боб Вайс за обратна връзка за експеримента.