Отделение по науки за животните и храните, Университет в Кентъки, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати

влияние

Отделение за науки за животните и храните, Университет в Кентъки, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати

Отделение за науки за животните и храните, Университет в Кентъки, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати

Отделение по науки за животните и храните, Университет в Кентъки, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати

Департамент по принадлежност към науките за животните и храните, Университет в Кентъки, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати, Изследователска единица за производство на фуражни животни, Служба за земеделски изследвания, Министерство на земеделието на САЩ, Лексингтън, KY, 40546, Съединени американски щати

  • Британи Е. Харлоу,
  • Лори М. Лорънс,
  • Сюзън Хейс,
  • Андреа Крум,
  • Майкъл Д. Флайт

Фигури

Резюме

Нишестето от царевица е по-малко податливо на храносмилането в тънките черва на еднокопитните, отколкото нишестето от овес, а нишестето, което достига до задните черва, може да бъде използвано от микробиотата. Целта на настоящото проучване беше да се изследват ефектите на източника на нишесте върху микробиотата на конски фекалии. Тридесет коня бяха назначени за лечение: контрол (само сено), HC (високо царевица), HO (високо овес), LC (ниско царевица), LO (ниско овес) и LW (ниско гранулирано жито). Конете са получавали пълноценна фуражна диета (2 седмици; d -14 до d -1) преди диетите за лечение (2 седмици; d 1 до 14). Нишестето се въвежда постепенно, така че конете получават 50% от определеното количество нишесте (високо = 2 g нишесте/kg BW; ниско = 1 g нишесте/kg BW) с d 4 и 100% с d 11. Фекални проби са получени при края на периода само за фураж (S0; d -2) и на d 6 (S1) и d 13 (S2) от периода на обработка. Изброени са целулолитици, лактобацили, грам-положителни коки от група D (GPC), използващи лактат и амилолитици. Данните за изброяване бяха преобразувани в дневник и анализирани чрез повтарящи се мерки ANOVA. Налице са пробни взаимодействия на ден × лечение (P 0,05). Всички обработки с изключение на LO водят до повишени амилолитици и намалени целулолитици, но промените са по-големи при коне, хранени с царевица и пшеница (P Таблица 1. Химичен състав сено, царевица, овес и пшеница) .

Въпреки че би било желателно да се включи лечение с висока пшеница, средното съдържание на нишесте в пшеничните междинни продукти би изисквало ниво на прием над капацитета на конете. Следователно, не беше включено високо средно пшенично лечение. В съответствие с препоръчаните практики на хранене [26], източниците на нишесте бяха въведени в диетата постепенно, започвайки със следобедното хранене (15:00) на d 1 от периода на лечение. Конете получават 25% от определеното ниво на нишесте (високо = 2 g нишесте/kg BW; ниско = 1 g нишесте/kg BW) на d 1 до 3, 50% на d 4 до 7, 75% на d 8 до 10 и 100% на d 11 до 14. Конете получават допълнително ½ от определеното им ниво на нишесте сутрин преди избирателната активност (08:00).

Фекалните проби бяха събрани при три пъти за вземане на проби. Първоначалната проба беше събрана в края на периода само за фураж, преди да бъдат въведени източници на нишесте (S0; d -2). Следващите проби бяха събрани на d 6 (S1) и на d 13 от периода на хранене с нишесте (S2). Фекалиите се събират по време на дефекация като проби от улов преди контакт с пода, за да се избегне замърсяване на земята.

Веднага след събирането на S0, S1 и S2 подпроба (приблизително 1 g) от пресните изпражнения се поставя в предварително претеглена стерилна епруветка Hungate за последващо бактериално изброяване. След като пробата попадне в епруветката, гумената запушалка се сменя и епруветката се продухва с въздух с CO2 за 30 секунди чрез туберкулинова игла. След това тези пресни проби се поддържат при 37 ° С и се транспортират в лабораторията в рамките на 2 часа след събирането. Останалите изпражнения във всяка колекция са използвани за определяне на pH на фекалните течности, фекални DM и концентрации на мастна киселина с къса верига (SCFA). PH на фекалната течност се определя непосредствено след събирането чрез изстискване на част от всяка фекална проба, за да се получи фекална течност за измерване на pH с помощта на преносим рН метър (IQ 150, точност ± 0,01 рН единици; IQ Scientific Instruments, Loveland, CO). Приблизително 100 g проба бяха транспортирани в найлонов плик до лабораторията за анализ на фекален DM и две 15 ml конични епруветки с изпражнения бяха замразени (-20 ° C) за по-късен SCFA анализ.

Изброяване на бактерии

При пристигане в лабораторията епруветките на Hungate се претеглят и всяка проба се подлага на 10-кратно разреждане (w/w) с анаеробна PBS (pH 7,4, N2-барботирана; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2PO4, 0,24 g KH2PO4 на L) и се смесва чрез вихър, докато суспензията стане хомогенна (

45 сек). След това фекалните суспензии бяха серийно разредени (10 пъти т/т, анаеробна PBS) в анаеробна камера (Coy, Grass Lake, MI, 95% CO2, 5% H2) за инокулиране на изброяващата среда.

Общите амилолитични бактерии бяха изброени в анаеробна течна среда с разтворимо нишесте от картофи [27]. Епруветките се инкубират (37 ° С, 3 d). Най-високото разреждане, показващо бактериален растеж (визуално изследване), е записано като жизнеспособно число. Lancefield група D Грам положителни коки (GPC), които включват Enterococcus spp., Streptococcus bovis и S. equinus, са изброени на агарен азиден жлъчен ескулин (Enterococcosel; BD, Franklin Lake, NJ). Lactobacillus spp. са изброени на агар Rogosa SL (BD). Плаките се инкубират аеробно (37 ° С, 3 d). Плочи с 30 × -1) и дефибринирана конска кръв (5%; Quad Five, Ryegate, MT, USA). Плаките се изсипват, инокулират и инкубират (37 ° С, 24 часа) в анаеробна камера, както е описано по-горе. Изолатът, който изглежда е E. coli, е многократно повторно изолиран и е отглеждан аеробно върху селективен и диференциален агар на E. coli (CHROMagar ™ E. coli; Chromagar, Париж). Той е отгледан в присъствието на монензин (10 μM), за да се гарантира, че няма Грам-положителни замърсители.

Филогенетичната идентичност се определя чрез секвениране на 16S РНК гени. Накратко, ДНК беше извлечена от всеки изолат (лизозим и ахромопептидаза с утаяване на етанол), амплифицирана с помощта на PCR универсални 16S праймери (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 3'-ACGGCTACCTTTTGTTACG на Кентъки, Център за модерни генетични технологии (Лексингтън, Кентъки), използвайки ABI 3730 ДНК анализатор (Applied Biosystems, Norwalk, CT). Поредиците бяха подравнени и анализирани с помощта на Geneious (v. 5.1; [30]). Най-близките филогенетични роднини на изолатите бяха определени с помощта на BLAST търсене на GenBank [31].

SCFA анализи

Фекалните проби се размразяват, смесват се с вода (50% w/w) и се избистрят в микроцентрифуга (21 000 × g, 2 минути). Твърдите частици бяха отстранени от супернатантите с подготвителни колони за микроцентрифуги (Amicon Ultra-4 центробежен филтър; Millipore). Мастнокиселините с къса верига са количествено определени с помощта на HPLC метод, използван преди това от нашата изследователска група и други (27, 32). Инструментът е Dionex HPLC (Сънивейл, Калифорния), оборудван с анионообменна колона (Aminex HP-87H; Bio-Rad, Hercules, CA), индекс на пречупване (Shodex/Showa Denko, Kanagawa, Япония) и UV детектор (Dionex, Сънивейл, Калифорния). Колоната се работеше при 50 ° С с дебит от 0,4 ml/min и H2SO4 (0,17 N) подвижна фаза. Етапът на разреждане с вода се отчита в резултатите.

Статистически анализи

Изброяване на амилолитични бактерии

Имаше лечение × пробно взаимодействие на ден за изброяване на амилолитични бактерии с висок прием на нишесте (P 0,05).

(а) Конете са назначени за третиране: само сено (CON; n = 4), висок овес (HO; n = 4; 2 g нишесте/kg BW) или високо царевица (HC; n = 4; 2 g нишесте/kg BW). (б) Конете са били назначени за третиране: само сено (CON; n = 5), нисък овес (LO; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), ниско царевица (LC; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), или ниско жито (LW; n = 5; 1 g нишесте/kg BW). Първоначална проба беше получена в края на периода на хранене само с фураж (S0; черни ленти), преди да бъдат въведени източници на нишесте. Допълнителни проби бяха взети на d 6, когато конете са получавали 50% от назначения източник на нишесте (S1; отворени решетки) и на d 13, когато са получавали 100% от назначения източник на нишесте (S2; сиви ленти). Изброяванията се извършват в анаеробна течна среда с разтворимо нишесте като субстрат за растеж. Епруветките се инкубират (37 ° С, 3 d) и крайното разреждане, показващо бактериален растеж, се записва като жизнеспособното число. Средствата, в които липсва обща английска буква, са различни в рамките на пробния ден (P Таблица 4. Най-близкият филогенетичен роднина на изолатите на еднокопитни амилолитични бактерии (> 97% идентичност на 16S генна последователност).

Съществува връзка между лечението и преобладаването на E. faecalis върху S1 (50% нишесте; P = 0,0617) и S2 (100% нишесте; P = 0,0082). Enterococcus faecalis е най-честата преобладаваща бактерия както при царевица, така и при пшенично хранени коне (S1, 7/10 E. faecalis; S2, 10/10 E. faecalis). За разлика от тях, овце, хранени с овес, са имали различни преобладаващи амилолитични бактерии върху S1 и S2 (7/14 Enterococcus spp., 4/14 Streptococcus spp., 2/14 Lactococcus lactis, 1/14 Clostridium sordellii).

Освен това е имало връзка между пробния ден и преобладаването на E. faecalis в рамките на HC (P = 0.0764), HO (P = 0.0941), LC (P = 0.0022) и LW (P = 0.0271). При коне, хранени с царевица (както HC, така и LC), честотата на изолиране на E. faecalis се увеличава с увеличаване на приема на нишесте (HC: S0, 2/7 E. faecalis; S1, 57% E. faecalis; S2, 100% E faecalis), а подобна тенденция се наблюдава и при средно хранени коне от пшеница (S0, 25% E. faecalis; S1 и S2, 100% E. faecalis). За разлика от това, честотата на изолиране на E. faecalis намалява с увеличаване на приема на нишесте при HO коне. На S2 E. faecalis не е изолиран от нито един кон, хранен с диета HO.

Изброяване на GPC бактерии

В края на само фуражния период, когато всички коне са били хранени само със сено (S0), броят на GPC бактериите, наблюдавани в изпражненията на отделни коне, варира от 2.05 × 10 4 до 6.55 × 10 5 cfu/g изпражнения . Имаше лечение × пробно взаимодействие на ден за изброяване на фекални GPC с висок прием на нишесте (P Фиг. 2. Ефектът от хранителния източник на нишесте (царевица, овес и пшеница) върху жизнеспособния брой грам-положителни коки от група D (GPC; ентерококи и Streptococcus bovis/equinus) в еднокопитни изпражнения.

(а) Конете са назначени за третиране: само сено (CON; n = 4), висок овес (HO; n = 4; 2 g нишесте/kg BW) или високо царевица (HC; n = 4; 2 g нишесте/kg BW). (б) Конете са били назначени за третиране: само сено (CON; n = 5), нисък овес (LO; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), ниско царевица (LC; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), или ниско жито (LW; n = 5; 1 g нишесте/kg BW). Първоначална проба беше получена в края на периода на хранене само с фураж (S0; черни ленти), преди да бъдат въведени източници на нишесте. Допълнителни проби бяха взети на d 6, когато конете са получавали 50% от назначения източник на нишесте (S1; отворени решетки) и на d 13, когато са получавали 100% от назначения източник на нишесте (S2; сиви ленти). Средствата, в които липсва обща английска буква, се различават в рамките на пробната дневна точка (P 4 до 9,65 × 10 4 cfu/g изпражнения в S0. Имаше взаимодействие × пробно взаимодействие за изброяване на лактобацили с висок прием на нишесте (P 0,05), но намалява в HC коне (P Фиг. 3. Ефектът от хранителния източник на нишесте (царевица, овес и пшеница) върху жизнеспособния брой лактобацили в изпражненията на еднокопитни.

(а) Конете са назначени за третиране: само сено (CON; n = 4), висок овес (HO; n = 4; 2 g нишесте kg BW -1) или високо царевица (HC; n = 4; 2 g нишесте/kg BW). (б) Конете са били назначени за третиране: само сено (CON; n = 5), нисък овес (LO; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), ниско царевица (LC; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), или ниско жито (LW; n = 5; 1 g нишесте/kg BW). Първоначална проба беше получена в края на периода на хранене само с фураж (S0; черни ленти), преди да бъдат въведени източници на нишесте. Допълнителни проби бяха взети на d 6, когато конете са получавали 50% от назначения източник на нишесте (S1; отворени решетки) и на d 13, когато са получавали 100% от назначения източник на нишесте (S2; сиви ленти). Средствата, в които липсва обща английска буква, са различни в рамките на пробния ден (P 5 до 4,55 × 10 5 cfu/g. Имаше взаимодействие × пробен ден взаимодействие за общите изброявания на бактерии, използващи лактат с висок прием на нишесте (P 0,05). Имаше и лечение × пробно взаимодействие на ден за общо използващи лактат бактерии с нисък прием на нишесте (P 0,05).

(а) Конете са назначени за третиране: само сено (CON; n = 4), висок овес (HO; n = 4; 2 g нишесте/kg BW) или високо царевица (HC; n = 4; 2 g нишесте/kg BW). (б) Конете са били назначени за третиране: само сено (CON; n = 5), нисък овес (LO; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), ниско царевица (LC; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), или ниско жито (LW; n = 5; 1 g нишесте/kg BW). Първоначална проба беше получена в края на периода на хранене само с фураж (S0; черни ленти), преди да бъдат въведени източници на нишесте. Допълнителни проби бяха взети на d 6, когато конете са получавали 50% от назначения източник на нишесте (S1; отворени решетки) и на d 13, когато са получавали 100% от назначения източник на нишесте (S2; сиви ленти). Средствата, в които липсва обща английска буква, са различни в рамките на деня на пробата (P 6 до 10 7 cfu/g. Броят на целулолитичните бактерии остава постоянен при коне, хранени с контролна диета, но намалява при коне, хранени с HC и HO (лечение × пробен ден: P 0,05).

(а) Конете са назначени за третиране: само сено (CON; n = 4), висок овес (HO; n = 4; 2 g нишесте/kg BW) или високо царевица (HC; n = 4; 2 g нишесте/kg BW). (б) Конете са били назначени за третиране: само сено (CON; n = 5), нисък овес (LO; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), ниско царевица (LC; n = 5; 1 g нишесте/kg BW), или ниско жито (LW; n = 5; 1 g нишесте/kg BW). Първоначална проба беше получена в края на периода на хранене само с фураж (S0; черни ленти), преди да бъдат въведени източници на нишесте. Допълнителни проби бяха взети на d 6, когато конете са получавали 50% от назначения източник на нишесте (S1; отворени решетки) и на d 13, когато са получавали 100% от назначения източник на нишесте (S2; сиви ленти). Средствата, в които липсва обща английска буква, са различни в рамките на пробния ден (P 97% 16S идентичност на генната последователност) и характеризирането.

Благодарности

Информацията, докладвана в тази статия (№ 15-07-084), е част от проект на селскостопанската експериментална станция в Кентъки и се публикува с одобрението на директора. Тази работа се подкрепя от Националните институти по храните и земеделието (люк) и от производителите на овес от прерията. MDF беше подкрепен от USDA-ARS, Национална програма 215. Авторите признават техническата помощ на Глория Гелин и помощта за животновъдството на Лора Штрасингер, Ашли Фаулър и Тейлър Хансен.

Собствените имена или търговски марки са необходими, за да се отчитат фактически наличните данни; USDA обаче нито гарантира, нито гарантира стандарта на продукта, а използването на името от USDA не предполага одобрение на продукта, нито изключване на други, които могат да бъдат подходящи. USDA е работодател с равни възможности.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: BEH LML MDF. Извърши експериментите: BEH SHH AC. Анализирани данни: BEH LML. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: LML MDF. Написа хартията: BEH LML MDF.