Клон за диабет, ендокринология и затлъстяване, Национален институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания, Национален здравен институт, Бетезда, Мериленд, Съединени американски щати

излагане

Клон за диабет, ендокринология и затлъстяване, Национален институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания, Национален здравен институт, Бетезда, Мериленд, Съединени американски щати

Свързано ядро ​​на метаболизма на мишката, Национален институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания, Национален здравен институт, Бетесда, Мериленд, Съединени американски щати

Клон за диабет, ендокринология и затлъстяване, Национален институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания, Национален здравен институт, Бетезда, Мериленд, Съединени американски щати

  • Ян Равусин,
  • Cuiying Xiao,
  • Оксана Гаврилова,
  • Марк Л. Райтман

Фигури

Резюме

Цитат: Ravussin Y, Xiao C, Gavrilova O, Reitman ML (2014) Ефект от периодично излагане на студ върху активирането на кафяви мазнини, затлъстяването и енергийната хомеостаза при мишки. PLoS ONE 9 (1): e85876. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085876

Редактор: Марсия Б. Агила, Държавен университет в Рио де Жанейро, Биомедицински център, Институт по биология, Бразилия

Получено: 10 септември 2013 г .; Прието: 3 декември 2013 г .; Публикувано: 17 януари 2014 г.

Това е статия с отворен достъп, без никакви авторски права и може да бъде възпроизвеждана, разпространявана, предавана, модифицирана, надграждана или използвана по друг начин от всеки за каквато и да е законна цел. Произведението е предоставено на базата на Creative Commons CC0, посветена на публичното достояние.

Финансиране: Това изследване беше подкрепено от Програмата за вътрешни изследвания (ZIA DK075062, ZIA DK075064, ZIA DK070002) на Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания (NIDDK), NIH. YR беше подкрепен с безвъзмездна помощ от Швейцарския национален фонд за научни изследвания (SNF). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Вдъхновени от полезните ефекти на упражненията, присъщ прекъсващ процес, ние изследваме ефектите от периодичното излагане на студ. Експерименти с периодично излагане на студ са провеждани при гризачи, но много от тези експерименти оценяват промените в толерантността към студ, параметрите на топлинните загуби [16], [17] и поведението на хранене, а не конкретно дали студът облекчава негативните последици за здравето от затлъстяването. Не е известно дали повишаването на ендогенното активиране на НДНТ чрез стимули от околната среда (напр. Излагане на студ) може да доведе до метаболитни подобрения в модел на мишки, предизвикани от диета със затлъстяване (DIO).

Модулирането на температурата на околната среда, за да повлияе на метаболизма, е привлекателна идея, която наскоро придоби популярност. Предполага се, че по-ниските температури в човешките жилищни пространства могат да намалят телесното тегло и да облекчат съпътстващите заболявания при затлъстяване [6] чрез увеличаване на количеството и/или активността на НДНТ. Целта на настоящото проучване беше да се оценят метаболитните ефекти на периодично излагане на студ при мишки DIO C57BL/6J.

Материали и методи

Животни и диета

Закупени са четиринадесетседмични мъжки мишки DIO C57BL/6J, които са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини, започваща на 6-седмична възраст (D12492, 60% kcal мазнини, 5,24 метаболизиращи kcal/g; Research Diets, New Brunswick, NJ) от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME). В NIH животните бяха настанявани индивидуално при 22–24 ° C с 12∶12-часов цикъл на тъмна светлина (светлините са включени в 0600h) в чисто, конвенционално съоръжение в пластмасови кошари с постелки от дървесен чипс и ad-libitum достъп до D12492 диета и вода. Протоколът е одобрен от институционалния комитет за грижа и употреба на животните NIDDK.

Уча дизайн

ICE # 1 и ICE # 2.

След 4-седмичен период на аклиматизация, мишките бяха класирани по тегло и разпределени в три групи (8 мишки/група) с еднаква средна телесна маса. В дните на студено излагане (понеделник, сряда, петък) се измерва телесното тегло и приема на храна и клетките се прехвърлят в стая с 4 ° C за посочения брой часове (периодично излагане на студ: ICE). Контролните мишки бяха преместени по подобен начин в нова стая при 22 ° С за 1 час (ICE # 1) или 4 часа (ICE # 2). Съставът на тялото (маса на мазнините и маса без мазнини) се измерва чрез Echo MRI 3-в-1 (Echo Medical Systems, Хюстън, Тексас) на всеки 2 седмици рано сутрин.

След 4-седмичен период на аклиматизация, мишките бяха класирани по тегло и разпределени в четири групи (6 мишки/група) с еднаква средна телесна маса. Две групи бяха изложени на 4 ° С в продължение на 4 часа три пъти седмично, докато 2 контролни групи бяха третирани по същия начин при 22 ° С (контрола: CON). Мишките бяха третирани ежедневно или с носител, или с AM251 (3 mg/kg в 5% DMSO/5% Tween 80 във физиологичен разтвор; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) чрез орален сондаж. Телесното тегло и приемът на храна се измерват ежедневно преди сонда.

В края на проучванията на мишките се прилага кетамин (100 mg/kg) и ксилазин (10 mg/kg) чрез ip инжекция, кръв се получава чрез ретро-орбитално кървене и тъканите се отстраняват, претеглят и замразяват при -80 ° C до анализ.

Общ разход на енергия

Средният общ енергиен разход (TEE) е изчислен с помощта на техниката за енергиен баланс (прием на калории минус промяна в запасите от енергия на тялото) [18]. Накратко, калоричните еквиваленти на телесния състав (мастна маса, 9,4 kcal/g; обезмаслена маса, 1,0 kcal/g) се използват за коригиране на промените в телесния състав. Увеличението на телесното съдържание на kcal се изважда от общия метаболизиращ се енергиен прием, като се получава TEE, което се разделя на продължителността на експеримента (ICE # 1 - 77 дни; ICE # 2 - 74 дни; ICE # 3 - 28 дни), за да се получи средната дневна TEE.

CL316243 лечение

CL316243, селективен β3-адренорецепторен агонист е използван за максимално стимулиране на факултативната термогенеза по време на индиректна калориметрия [19]. Тези експерименти са проведени при термонеутралност (30 ° С), за да се елиминира ендогенното активиране на НДНТ. Мишките бяха поставени в 12-камерни контролирани от околната среда CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH) рано сутринта (0645h), аклиматизирани за hours4 часа, третирани с CL316243 (100 µg/kg във физиологичен разтвор, ip) и енергийни разходи беше измерен за още 5 часа. Мишките имаха свободен достъп до храна и вода през целия период на тестване.

Тест за толерантност към перитонеална глюкоза (ipGTT)

Мишките бяха на гладно през нощта, глюкоза (1 g/kg телесно тегло, ip) се инжектира на 0900h и се измерва глюкозата в кръвта в опашката (Glucometer Contour, Bayer, Mishawaka, IN) на 0, 15, 30, 60 и 120 минути след инжектирането . IpGTT се провежда един ден след излагане на студ в ICE # 1 и ICE # 3 и два дни след излагане на студ в ICE # 2, за да се изследва продължителността на ефектите на излагане на студ. В ICE # 2 концентрациите на инсулин също се определят на 0, 15 и 120 минути чрез RIA (Millipore, St. Charles, MO).

Тест за инсулинова толерантност (ITT)

Негладните мишки се инжектират с 0,75 U/kg телесно тегло инсулин (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN) на 0900h. Концентрациите на глюкоза в опашката в кръвта са измерени на 0, 15, 30, 45, 60 и 120 минути след инжектирането.

Поглъщане на глюкоза

В ICE # 1, in vivo поглъщането на глюкоза се измерва чрез ip инжекция на [1- 14 С] 2-деоксиглюкоза (10 uCi, Perkin Elmer, Бостън, МА) един час преди прекратяване на мишките. Мишките се инжектират при започване на излагане на студ в групата от 1 h и 3 часа след началото на излагането на студ в групата от 4 h. Шестдесет минути след инжектирането, две мускули (квадрицепс и гастрокнемиус), две мастни подложки (ингвинална и епидидимна), междулопаточна НДНТ и далакът бяха отстранени, претеглени, хомогенизирани и [14 С] 2-деоксиглюкоза 6-фосфат беше извлечен с помощта на Предварително напълнени колони за хроматография с многократна подготовка (Bio-Rad Laboratories, Cat: 731-6211, Hercules, CA) и количествено изчислени с помощта на течен сцинтилационен брояч на Beckman [20].

Профили на серумен хормон и метаболит

Кръв от ретро-орбитално кървене се поставя в епруветки за сепаратор на BD Microtainer (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), оставя се да се съсирва за 10 минути при стайна температура, върти се при 10 000 об/мин за 6 минути и серумът се замразява анализиран. Свободни мастни киселини (Roche Diagnostics Gmbh, Манхайм, Германия), триглицериди (Pointe Scientific Inc., Кантон, Мичиган), холестерол (Thermo Scientific, Middletown, VA), β-хидроксибутират (BioVision, Milpitas, CA) и D-лактат (BioVision, Milpitas, Калифорния) бяха измерени чрез колориметрични анализи. Глюкозата в серума се измерва с Glucometer Contour. Инсулин (Millipore, St. Charles, MO), адипонектин (Millipore, St. Charles, MO), инсулиноподобен растежен фактор 1 (ALPCO, Salem, NH), T3 (DiaSorin Inc, Stillwater, MN) и T4 (DiaSorin Inc, Stillwater, MN) са измерени от RIA. Лептин (R&D Systems, Минеаполис, MN) и фибробластен растежен фактор 21 (Millipore, St. Charles, MO) бяха измерени чрез ELISA. Всички анализи бяха проведени съгласно протокола на производителя.

Анализи на генната експресия

РНК се извлича (Qiagen RNeasy Plus Mini Kit, Germantown, MD), превръща се в cDNA (Roche Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, Indianapolis, IN) и се определя количествено чрез полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR, Applied Biosystems 7900HT, Фостър Сити, Калифорния). Използвани са както SYBR базирани на зелена, така и система за грундиране taqman.

статистически анализи

Данните са изразени като средно за групата ± SE. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на JMP (версия 9; SAS, Северна Каролина). За ICE # 1 и ICE # 2 бяха проведени еднопосочни ANOVA, като се използва група мишки като независими променливи (CON, 1 h, 4 h за ICE # 1 и CON, 4 h, 8 h за ICE # 2). За ICE # 3 двупосочните ANOVA използват излагане на студ (ICE или CON) и лечение с наркотици (AM или VEH) като променливи за групиране. За значими резултати от ANOVA е проведен пост-хок тест на Tukey HSD за сравнение между групите. Статистическата значимост е определена за перспектива като P Фигура 1. Студената експозиция увеличава приема на храна, но не и телесното тегло.

A: Калоричен прием и B: телесно тегло по време на експерименти с ICE # 1 (отгоре) и ICE # 2 (отдолу) са измервани три пъти седмично в дните на излагане на студ. Посочени са сроковете на интраперитонеалните тестове за толерантност към глюкоза (GTT) и CL316243 (CL). Данните са средни ± SE, N = 8/група. 8-часовата група е имала по-висок прием на храна, оценена чрез многократни мерки ANOVA (p Таблица 1. ДВЕ # 1, ефект от 1 час и 4 часа студено излагане три пъти седмично.

Активиране на НДНТ чрез излагане на студ

Като сонда за индуцирани от студа промени в мастната физиология, CL316243, селективен агонист на β3-адренергичните рецептори, беше използван за оценка на способността за генериране на топлина [19]. При контролните мишки CL316243 увеличи TEE с ∼2,5 пъти от термонеутралната базова линия (Фигура 2). Изложените на студ мишки са имали по-голямо увеличение на метаболизма след инжектиране на CL316243, отколкото контролите: 6,5% (не е значително) и 19% (p Фигура 2. Предишното излагане на студ увеличава енергийните разходи, предизвикани от CL316243.

Взети заедно, тези данни показват, че периодичното излагане на студ увеличава термогенния капацитет, с умерено увеличаване на иРНК маркерите за активиране на НДНТ и липса на последователно активиране на бежовата/наситената мастна тъкан.

Студен ефект върху енергийната хомеостаза

В ICE # 1 беше проведен ipGTT на следващия ден след излагане на студ, за да се изследват ефектите от излагането на студ върху глюкозния толеранс. 4-часовата група е имала намалени концентрации на глюкоза в повечето времеви точки и значително по-ниска площ под кривата (AUC) в сравнение с 1-часовата група (Фигура 3 Горна част). В ICE # 2 ipGTT беше извършен два дни след излагане на студ на сонда за по-дълготрайни ефекти. С тази парадигма не се наблюдава съществен ефект (Фигура 3 отдолу), което предполага, че има умерен, преходен благоприятен ефект от излагането на студ върху ipGTT.

В ICE # 1 (отгоре) и ICE # 2 (отдолу), интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза (1 g/kg) бяха проведени при мишките на гладно през нощта. При ICE # 1 ipGTT се провежда на следващия ден след излагане на студ, докато при ICE # 2 се провежда на втория ден след излагане на студ. Вмъкването показва средната площ на AUC в mg/dl • min ± SE, N = 8/група. Нивата, които не са свързани с една и съща буква, са значително различни (P Фигура 4. Ефекти от AM251 и излагане на студ.

На мишките се прилага вехикулум или AM251 (3 mg/kg/ден) чрез орален сондаж. A: Калоричен прием и B: телесното тегло се измерва три пъти седмично в дните на студено излагане. C: На мишки при 30 ° C се прилага CL316243 (100 µg/kg) във време 0, както е описано в експериментални процедури (предишният AM251 е даден на -24 часа). Вложката показва делта TEE, изчислена, както е показано на Фигура 2. Двупосочният ANOVA показа значителна температура (p Таблица 4. ДВЕ # 3, ефект на ежедневното AM251 и на 4 часа студено излагане три пъти седмично.

Както се очаква, кумулативният прием на храна е значително намален с AM251 при CON мишки. AM251 също намалява приема на храна при студено изложени мишки, но не инхибира компенсаторното увеличение на приема на храна, причинено от повишеното TEE на студено излагане (Фигура 4В). Двупосочен ANOVA анализ на TEE разкри, че излагането на студ значително увеличава TEE, но AM251 не (Таблица 4). По този начин няма доказателства за увеличени (или намалени) ползи от комбинирането на излагане на студ и AM251 върху телесното тегло, мастната маса или приема на храна.

AM251 намалява разхода на енергия, предизвикан от CL316243, но не засяга специфичните маркери за НДНТ