Йънгми Юнг

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Inyoung Kim

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Мохамед Манна

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Джинюн Ким

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Sihyung Wang

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Inmyoung Park

2 Катедра по азиатски храни и кулинарни изкуства, Университет Youngsan, Пусан, 48015 Корея

Jieun Kim

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Йънг-Су Сео

1 Катедра за интегрирана биологична наука, Национален университет Пусан, Пусан, 46241 Корея

Резюме

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е едно от най-честите чернодробни заболявания. Наскоро бяха открити възможни връзки между чревната микробиота и метаболизма на гостоприемника в развитието на NAFLD и затлъстяването. Следователно, разбирането на промените в чревната микробиота по време на прогресията на NAFLD е важно. В това проучване ефектът на чая Kombucha (KT), получен чрез микробна ферментация на захарен черен чай, е изследван върху чревната микробиота по време на прогресията на NAFLD. Резултатите показват намаляване на класа Erysipelotrichia чрез лечение с KT в сравнение с мишки с db/db, хранени с метионин/холин с дефицит (MCD). Allobaculum, Turicibacter и Clostridium родове са открити само при мишки, хранени с MCD db/db, и са намалени след третиране с KT, докато Lactobacillus е по-разпространен при мишки, хранени с MCD + KT, отколкото при мишки, хранени само с MCD, и Mucispirillum, открити само в групата на MCD + KT-хранени мишки. Нашите резултати демонстрираха, че промяната на чревната микробиота е повлияна от приема на КТ, допринасяйки за борба с NAFLD.

Въведение

Напоследък връзката между чревната микробиота и мастната чернодробна болест е изяснена до известна степен. На анатомично място черният дроб се доставя директно с около 70% от кръвния поток през порталната вена. Тази ос на червата и черния дроб служи като път за излагане на черния дроб на антигени или токсични фактори, произведени от чревната микробиота (Сравни и др., 2012). Бактериалните странични продукти като амоняк, феноли и етанол са потенциално хепатотоксични и могат да допринесат за развитието на чернодробни заболявания (Abu-Shanab and Quigley, 2010). Нещо повече, бактериалните липополизахариди (LPS) са основно свързани с NAFLD. LPS, абсорбиран по време на липидната абсорбция, предизвиква каскада от вътреклетъчни процеси чрез свързване със специфичен протеин и индуцира възпаление чрез засилване на експресията на целевите гени (Machado и Cortez-Pinto, 2012). Няколко проучвания предполагат връзката между чревната микробиота и чревната пропускливост с тежестта на чернодробната стеатоза. По този начин се очаква интервенциите за модулация на чревната микробиота (например пробиотици, пребиотици и стандартизация на диетата) да бъдат полезни за профилактика или лечение на такива състояния (Daubioul et al., 2000; Machado and Cortez-Pinto, 2012; Spencer et al., 2011).

Чаят Kombucha (KT) е безалкохолна ферментирала напитка, която е пенлива и има кисел вкус. KT се произвежда чрез ферментация на смес от черен чай, захароза и чаена гъба. Ферментацията се извършва чрез микробен метаболизъм, като се използва симбиозата между бактерии и дрожди (Jarrell et al., 2000). Напитката е придобила популярност по целия свят със своите ползи за здравето, като антимикробна (Sreeramulu et al., 2000), антиоксидант (Chu и Chen, 2006), антиканцерогенна (Jayabalan et al., 2011), и антидиабетни ефекти (Aloulou et al., 2012). Въпреки че KT се очертава като защитно вещество срещу увреждане на черния дроб, ефектът на KT върху NAFLD все още остава неясен. В предишно проучване ние изследвахме дали KT повлиява чернодробната стеатоза и установихме, че е ефективен за отслабване на натрупването на липиди в черния дроб, като по този начин предпазва черния дроб от увреждане (Hyun et al., 2016). Следователно целта на това проучване е чрез метагеномни анализи да се изследва дали чревната микробиота се е променила по време на прогресията на NAFLD при индукция от KT и нейния ефект върху натрупването на мазнини в черния дроб.

Материали и методи

Приготвяне на екстракт от Kombucha

Шест грама черен чай (вид чаена торбичка, Lipton, Yellow Label Tea) се добавят към 600 ml вряща дестилирана вода, оставя се да се влива в продължение на 5 минути, след което чаената торбичка се отстранява. След това се добавят 10% (w/v) захароза и се разбърква, за да се разтвори в черния чай. След охлаждане до стайна температура, чаят се излива в 1 L стъклена чаша, която преди това е била стерилизирана при 121 ° C в продължение на 20 минути. И накрая, прясно приготвеният чай беше инокулиран с прясно отглеждана подложка Kombucha, която беше култивирана в същата среда в продължение на 14 дни и 30% от предварително ферментиралия течен бульон от чай. Бехеровата чаша беше покрита с чист плат за сирене и фиксирана с ластици. Ферментацията (при 25 ± 3 ° С) продължи 14 дни. По време на ферментацията върху повърхността на чая се развива дъщерна постелка (нова постелка Kombucha). Ферментиралата Kombucha се центрофугира при 7000 × g в продължение на 20 минути и супернатантата се филтрира през 0,45 μm (размер на порите) филтър за спринцовка (Sartorius, Minisart спринцовъчни филтри). По-късно филтрираните екстракти бяха замразени при - 80 ° С, преди да бъдат подложени на лиофилизация. Лиофилизираният екстракт от KT се съхранява при - 20 ° C до по-нататъшна употреба.

Животни и лечение

Шестседмични мъжки мишки C57BLKS db/db са закупени от Корейския изследователски институт по бионаука и биотехнологии (KRIBB, Daejeon, Корея). По време на аклиматизацията мишките бяха хранени с нормална диета и вода и бяха настанени с 12-часов цикъл светлина/тъмнина в продължение на 2-3 седмици. Дванадесет db/db 8-седмични мишки (средно телесно тегло 38 g) са били хранени или с контролната диета (n = 4), или с диета с дефицит на метионин/холин (MCD) (n = 8; котка № 518810; Централна лаборатория (Animal Inc., Сеул, Корея) в продължение на 4 седмици. Сред осемте мишки, хранени с диета с MCD, четири също са хранени с прах Kombucha 2 g/kg чрез орално приложение на всеки 24 часа в продължение на 3 седмици; останалите бяха третирани с вода вместо това. Kombucha прах, поддържан при - 80 ° C, беше напълно разтворен във вода и използван за лечение на животни.

Чернодробна хистология

Всяка чернодробна тъкан се събира за хистологичен анализ. Чернодробните образци бяха фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин, вграден в парафин 133 и нарязани на 4 μm участъци. Образците бяха обезпарафинирани, хидратирани и оцветени със стандартен протокол за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E).

Събиране на проби от изпражнения

Проби от изпражнения от всяка група db/db мишки (Група 1: Контрол, група 2: MCD, група 3: MCD + KT) се събират всяка седмица (в продължение на 4 седмици). Пробите на изпражненията се съхраняват при 4 ° С за по-нататъшни експерименти.

Метагеномна екстракция на ДНК

Метагеномната ДНК беше извлечена от приблизително 300 mg изпражнения, използвайки PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) с модификации. По-конкретно, топчестите тръби се нагряват до 65 ° С в продължение на 10 минути и след това се завихря хоризонтално, фиксирани с лента, върху вихрова подложка с плоско легло за 10 минути с максимална скорост. Останалите стъпки бяха извършени според указанията на инструкциите на производителя. Екстрахираната ДНК се определя количествено с помощта на спектрофотометър NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и се замразява при - 80 ° C до по-нататъшна употреба.

Последователност на метагенома

Извлечени проби от ДНК бяха изпратени до Националния инструментарен център за управление на околната среда (NICEM, Национален университет в Сеул, Сеул, Република Корея) за секвениране на метагеноми. Извлечената ДНК се използва за PCR-амплификация на 16S рибозомния РНК ген. PCR продуктите са използвани за секвениране на метагеноми от NICEM на 454 GS-FLX Titanium платформа (454 Life Sciences, Branford, CT, USA).

Микробиомен анализ

Филтрираните четени последователности бяха съпоставени с таксономичните идентификации, използвайки референтната база данни (Silva.bacteria, http://www.arb-silva.de), инструменти за референтно картографиране (ncbi-blast-2.2.30 +, ftp: // ncbi .nlm.nih.gov/blast/executables/blast +/LATEST /) и софтуер за таксономична класификация (MEGAN5 — MEtaGenome ANalyzer, http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/software/megan5/).

Резултати и дискусия

Чаят Kombucha (KT) предпазва от натрупване на мазнини при db/db мишки, хранени с MCD

За да се потвърдят съобщените по-рано липопротективни ефекти на КТ върху черния дроб (Hyun et al., 2016), е извършен чернодробен хистологичен анализ. Хистологичният анализ показва тежка стеатоза с прекомерно натрупване на макро- и микровезикуларни мазнини в черния дроб на db/db мишки, хранени с MCD, в сравнение с db/db мишки, хранени с чау (фиг. 1). В сравнение с MCD-хранени мишки без лечение с KT, се наблюдава лека стеатоза с намалени мастни капчици в черния дроб на MCD + KT-хранени db/db мишки. Тези данни предполагат, че KT намалява натрупването на мазнини при db/db мишки, хранени с MCD.

върху

Kombucha намалява натрупването на мазнини при db/db мишки, хранени с MCD. Хистоморфология на чернодробните секции, използващи H&E оцветяване от представителни (контролни) db/db мишки с нормално хранене, (MCD) db/db мишки, хранени с MCD и (MCD + KT) и третирани с комбуча мишки db/db, хранени с MCD ( × 40). Наблюдавано е прекомерно натрупване на макро- и микровезикуларни мазнини в черен дроб на хранени с MCD db/db мишки в сравнение с нормално хранени мишки db/db и третирани с KT мишки

Анализ на последователността на 16S рРНК региона

контролна група са нормално хранени db/db мишки за 0, 1, 2 и 3 седмици

b MCD група са хранени с MCD db/db мишки за 1, 2 и 3 седмици

c MCD + KT група са третирани с Kombucha MCD-хранени db/db мишки за 1, 2 и 3 седмици

Анализ на чревната микробиота между MCD- и MCD + KT-хранени db/db мишки

На ниво филум, Firmicutes и Bacteroidetes присъстват във висок процент във всички групи (фиг. 2 А). Съотношението на Firmicutes и Bacteroidetes е почти 1: 1 в контролни и MCD-хранени групи, докато делът на Bacteroidetes в MCD + KT-хранена група се увеличава с течение на времето. Mouzaki et al. (2013) установяват, че пациентите с NASH имат значително ниски нива на бактериодети в сравнение с тези с проста стеатоза и здрави контроли. Раман и сътр. (2013) също съобщават, че броят на Firmicutes е увеличен при пациенти с NAFLD спрямо контролите, които не са със затлъстяване. Въпреки това, резултатите от чревния микробиом за връзката на NASH със здравите контроли в детската група бяха контрастни (Zhu et al., 2013). Трудно е да се установят микробиомни изследвания за такива взаимоотношения, тъй като те са променливи в зависимост от експерименталния дизайн (Wieland et al., 2015). Непрекъснато натрупаните резултати помагат да се разбере връзката между мастната чернодробна болест и чревния микробиом.

Относително изобилие от бактерии (A) на ниво тип, и (Б.) на ниво клас във всяка проба от изпражнения от (контролни) db/db мишки с нормално хранене, мишки, хранени с MCD db/db и (MCD + KT) мишки, третирани с db/db мишки на MCD диета. Чревните микробни състави бяха оценени чрез секвениране на 16sr РНК региона от метагеномите на пробите на изпражненията, последвано от таксономични идентификации

На ниво клас, класът Erysipelotrichia, принадлежащ към Firmicutes phylum, показва интересен аспект (фиг. 2 Б). Класът Erysipelotrichia не съществува при db/db контролни мишки. Въпреки това, той се е увеличил приблизително с 45% само 1 седмица от началото на MCD диетата и доминира в общността. Интересното е, че високите нива на еризипелотрихия във фекалната микробиота са свързани с чернодробна стеатоза (Spencer et al., 2011). Предполага се, че нивото на еризипелотрихия е важен бактериален маркер за чувствителност към индуцирана от холин дефицит на мастна тъкан. Освен това, Allobaculum и Turicibacter, принадлежащи към класа Erysipelotrichia, са известни с това, че произвеждат късоверижни мастни киселини (SCFA) (Schwiertz et al., 2010). SCFA, произведени от чревни микроби, се считат за допълнителен източник на енергия за хората (Schwiertz et al., 2010). Следователно се смята, че метаболитите на различни микроби от това семейство влияят пряко или косвено върху индукцията на NAFLD.

Прозрение в промените в чревната микробиота, свързани с MCD-хранени db/db мишки, лекувани с KT

Промените в относителното изобилие на шест бактериални рода (Turicibacter, Allobaculum, Clostridium, Ruminococcus, Lactobacillus и Mucispirillum), чиито пропорции са променени чрез MCD или MCD + KT-лечение. Предполага се, че наблюдаваните промени в дела на тези родове са свързани с влиянието върху натрупването на мазнини в черния дроб и следователно неалкохолно мастно чернодробно заболяване

Макар и малък процент, родът Mucispirillum е открит само в групата на MCD + KT-хранени мишки. Известно е, че муциспирилум корелира положително с циркулиращия лептин (Ravussin et al., 2012). Лептинът е хормон, произведен от мастни клетки, които помагат за регулиране на енергийния баланс, като инхибират глада и поддържат постоянни телесни мазнини. Когато лептинът достигне мозъка, той намалява телесните мазнини, приема на храна, нивото на кръвната захар и т.н. и увеличава метаболитната ефективност или активност, като постепенно намалява теглото (Brennan and Mantzoros, 2006).

Това проучване показа, че лечението с KT води до промени в състава на микробиотата на чревните мишки. Делът на Bacteroidetes се увеличава с течение на времето само в групата, хранена с MCD + KT. Бактериите, принадлежащи към клас Erysipelotrichia, се увеличиха от 1-седмично хранене след MCD, като в крайна сметка доминираха в общността, но бяха значително намалени чрез лечение с KT на мишки, хранени с MCD db/db Бактериите, принадлежащи към Allobaculum, Turicibacter и Clostridium, бяха селективно намалени, докато бактериите, принадлежащи към Mucispirillum, намаляха само след лечение с KT. Взети заедно, настоящото проучване демонстрира непряка връзка между чревните микробиомични промени, причинени от KT при MCD-хранени db/db мишки и напредъка на NAFLD. Такива микробни промени могат да помогнат за потискане на натрупването на мазнини в черния дроб и съответно за намаляване на NAFLD. Надлъжното проучване върху чревния микробиом предполага, че непрекъснатото лечение с КТ може да помогне за подобряване на състоянието на чревния микробиом при пациенти с NAFLD.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от 2-годишен грант за научни изследвания на Националния университет в Пусан (Y.-S.S.).

Съответствие с етичните стандарти

Авторите не декларират конфликт на интереси.