Свързани данни

Резюме

Затлъстяването и свързаните с него заболявания са значителен проблем в световен мащаб и имат големи ефекти върху заболеваемостта и смъртността (1). Световната здравна организация през 2005 г. прогнозира, че до 2010 г. в САЩ 44,2% от възрастните мъже и 48,3% от възрастните жени ще бъдат със затлъстяване [индекс на телесна маса (BMI) ≥ 30 kg/m 2] (1). Проучване през 2010 г. изчислява, че 34,3–38,5% от всички възрастни страдат от метаболитен синдром, състояние, характеризиращо се с централно затлъстяване, диабет, хипертония и неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD), което представлява 6–7% от всички смъртни случаи (2, 3). Хипотезата на развитието на здравето и заболяванията или феталното програмиране гласи, че майчината среда има трайни ефекти върху плода до зряла възраст, което може да включва повишен риск от метаболитен синдром (2, 4). Тази хипотеза беше изложена от епидемиолозите Barker и Osmond (5), които откриха корелация между сърдечно-съдови заболявания при възрастни и ниско тегло при раждане, детска смъртност и лошо майчино здраве и хранене.

ефект

Материали и методи

Събиране на животни и тъкани

Всички процедури за животни са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета на Мисури и са извършени в съответствие с Националния ръководство за грижа и употреба на лабораторни животни.

Взети са кръвни проби от всички потомци по време на умъртвяването на животните и серумът се съхранява при -20 С. Пробите от черния дроб са събрани и поставени в триреагент (Sigma, Сейнт Луис, МО) или фиксирани в 4% параформалдехид (PFA) цяла нощ и след това се вгражда в съединение с оптимална температура на рязане (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) и се съхранява при -80 С. Пробите от подкожна мазнина, висцерална мазнина и хипоталамус се замразяват в течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 С. Левият бъбрек се събира, фиксира се в 4% PFA, разделя се наполовина на средно-сагитално, вгражда се в парафин и се съхранява при стайна температура. Проба от панкреас също беше събрана, фиксирана в 4% PFA, вградена в парафин и съхранявана при стайна температура. Бедрените кости се събират, почистват, увиват се в марля и се съхраняват при -20 ° С в PBS.

Ядрено-магнитен резонанс на малки животни (ЯМР)

Съставът на тялото е определен при 54 мъжки потомци на 21 седмици и 54 мъжки и 44 женски потомци на 27 седмици след 5 седмично излагане на диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Процентът на телесните мазнини се измерва с помощта на високоефективна 7T MR система за образно изследване и спектроскопия (Varian Inc., Санта Клара, Калифорния) в Центъра за биомолекулни изображения на ветераните в болницата за ветерани Harry S. Truman и Университета в Мисури-Колумбия, както е описано по-рано (33). Животните са анестезирани с изофлуран по време на проучването. ЯМР се извършва от диафрагмата до основата на опашката. Анализът на данните беше извършен с помощта на Mnova7software (Mestrelab Research, Сантяго де Компостела, Испания).

Поведенчески анализи

Поведенческата активност се проследява автоматично върху две мъжки и две женски потомци от всяка майка на 26 седмици, като се използват монитори на Med Associates 'Open Field Test Environment (ENV-515) (Джорджия, VT) в Translational Neuroscience Behavior Core в университета на Мисури-Колумбия, както е описано по-рано (33). Данните за прекъсване на сензора бяха използвани за измерване на изминатото разстояние. Времето, прекарано в средата на лабиринта спрямо периметъра, беше използвано за оценка на поведенческата тревожност. Мишките бяха привикнали до зоната за тестване за 3-4 часа и след това бяха поставени индивидуално в камерата за 60 минути. Изпитванията се провеждаха през ден за общо три изпитания на мишка.

Серумни анализи

Концентрациите на серумен лептин и инсулин са измерени при потомство, като се използва съответно лептин за мишки и инсулин ELISA от плъх/мишка (Millipore, Billerica, MA), следвайки указанията на производителя. Истинските серумни концентрации на триглицериди бяха измерени във всяко потомство, като се използва комплект за определяне на серумен триглицерид (Sigma), следвайки указанията на производителя. Интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза (IPGTT) са извършени на 13 мъжки (пет контролни, четири ограничени, четири лептина) и 25 женски потомци (10 контролни, осем ограничени, седем лептина) според протокола от консорциума на Националните здравни институти за животински диабетни усложнения (http://www.diacomp.org/shared/showFile.aspx?doctypeid=3&docid=11). Накратко, животните се гладуват в продължение на 6 часа и след това се получава ниво на глюкоза на гладно чрез проба от венозна опашка. След това беше приложена ip инжекция на глюкоза (1 mg/g) и нивата на кръвната глюкоза бяха получени на 30, 60 и 120 минути след инжектирането чрез проба от венозна опашка с помощта на глюкометър OneTouch Ultra (LifeScan Inc., Milpitas, CA ).

Морфология на бъбреците

Бъбреците бяха секционирани и оцветени с хематоксилин и еозин, а след това броят на гломерулите беше преброен в най-голямото напречно сечение на бъбреците, като се използва функцията за броене в софтуера ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Анализ на костите

Морфология на панкреаса

Проведена е имунохистохимия на панкреатична тъкан от 42 мъжки и 40 женски потомци. Накратко бяха изследвани пет 5-μm парафинови среза на интервали от 50 μm или повече на панкреас. След блокиране в 1:10 разтвор на нормален кози серум в PBS в продължение на 30 минути, всяка проба се оцветява двойно в продължение на една нощ с a-клетъчен маркер, миши антиглюкагон (K79bB10; Abcam Inc., Cambridge, MA) и β-клетка маркер, заешки анти-инсулин (ab63820; Abcam) при 1: 2000 и 1: 1000, съответно. Вторични антитела Alexa Flour 568 коза-антимишка и 488 коза-антирабит (Invitrogen, Carlsbad, CA) са използвани при 1: 500. Общо бяха изследвани 991 островчета, 515 женски (145 контролни, 202 ограничени, 168 лекувани с лептин) и 476 мъжки (178 контролни 157 ограничени 141 лектирани лептини) и средно 12,1 ± 0,4 островчета на кученце. Стойностите на островчетата бяха осреднени за животно. Броят на α- и β-клетките се определя с помощта на функцията за ръчно преброяване на ImageJ (Национален здравен институт). Β-клетките бяха ръчно обиколени и площта беше измерена, като се използва характеристиката Image J от интерес, както беше описано по-рано (35). Средната β-клетъчна площ на островче се използва като индекс на β-клетъчната маса.

Изолация на РНК и RT-PCR анализ в реално време

Общата клетъчна РНК е изолирана от черен дроб, sc мазнини, висцерална мазнина и хипоталамус. Пробите се хомогенизират в триреагент (Sigma) и след разделяне на фазите с помощта на тежки тръби с гел за фазово заключване (5 Prime Inc., Gaithersburg, MD), водният слой се поставя върху RNEasy миниколона (QIAGEN, Валенсия, Калифорния) и общо клетъчната РНК се пречиства съгласно инструкциите на производителя.

За чернодробни, висцерални и sc мазнини и количествена RT-PCR, 1 μg РНК се транскрибира обратно, като се използва RT 2 комплект от първа верига (QIAGEN), следвайки инструкциите на производителя. След това се извърши PCR в реално време с помощта на персонализиран PCR масив RT 2 Profiler, съдържащ множество PCR и RT 2 SYBR Green ROX qPCR master mix (QIAGEN) върху PCR система в реално време на Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ) съгласно указанията на производителя на PCR масива. Бяха изследвани три домакински гена, 18s рРНК (18s рибозомна РНК), Actb (актин-β) и Hprt (хипоксантин фосфорибозилтрансфераза 1); обаче, поради вариацията на израза от 18s и Hprt, само Actb е бил използван за изчисляване на промените в пъти. Производителите на външна обратна транскрипция и положителни PCR контроли също бяха включени.

За количествената RT-PCR на хипоталамуса 500 ng РНК се транскрибират обратно, като се използва системата за синтез на първа верига SuperScript (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. Провежда се SYBR Green PCR в реално време за Agrp (свързан с агути протеин), Cart (кокаин и амфетамин регулиран транскрипт), Npy (невропептид Y), Pomc (проопиомеланокортин), Lepra и Leprb (лептинов рецептор-а и -b). За вътрешен контрол се използва Actb. Поредици от праймери (Integrated DNA Technology, Coralville, IA) могат да бъдат намерени в Допълнителна таблица 1, публикувана на уебсайта на Endocrine Society's Journals Online на адрес http://endo.endojournals.org. Праймерните последователности на Lepra и Leprb са разработени с помощта на софтуер Primer Express (Applied Biosystems), Actb (36), Agrp, Cart, Npy и Pomc последователности от праймери са публикувани преди това (37).

Една мъжка и една женска чернодробна проба на майка са анализирани чрез PCR. Изследвани са две проби от мъжки и две женски sc мазнини, висцерална мастна тъкан и хипоталамус на майка.

Анализ на NAFLD

Завършен е хистологичен анализ на черен дроб на потомство (54 мъже, 44 жени) за NAFLD. Замразените чернодробни проби бяха разделени на 8 μm и три секции с интервал от 50 μm бяха поставени върху предметно стъкло. Пробите бяха оцветени с маслено червено O (Sigma) съгласно публикуваните насоки (38), оцветени с хематоксилин на Mayer (Sigma) и монтирани с глицериново желе. Чернодробните секции бяха оценени за NAFLD въз основа на публикувани насоки (39, 40). Накратко, общи характеристики, оценени от заслепен за лечение оператор, са хепатоцелуларен балон, стеатоза и портално възпаление. Отбелязан е и хиалинът на Mallory. Всяка аномалия във всяка чернодробна секция се класифицира с помощта на скала 0–3 със стойност 0, съответстваща на по-малко от 33% от пробата, покрита с аномалията. Стойност 1 съответстваше на 33-50%, 2 на 50-66% и 3 на наличие на аномалията в 66-100% от пробата. Общият резултат за всяка секция е сумата от аномалиите, диапазон от 0–9 (примери, допълнителна фигура 1). Средните оценки на три секции на животно бяха осреднени.