Алън М. Мартинес

5 Отдел по репродуктивна ендокринология и безплодие, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

ефекти

Ана Чонг

6 Отдел по генетика на околната среда и молекулярна токсикология, Катедра по екологично здраве, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

7 Център за генетика на околната среда, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

Джун Ин

8 Отдел по биостатистика и биоинформатика, Катедра по екологично здраве, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

Jingchuan Xue

9 Wadsworth Center, Министерство на здравеопазването на Ню Йорк и Департамент по екологични здравни науки, Училище за обществено здраве, Държавен университет в Ню Йорк в Олбани, Олбани, Ню Йорк

Kurunthachalam Kannan

9 Wadsworth Center, Министерство на здравеопазването на Ню Йорк и Департамент по екологични здравни науки, Училище за обществено здраве, Държавен университет в Ню Йорк в Олбани, Олбани, Ню Йорк

10 Биохимичен отдел, Факултет по наука и експериментална биохимия, Център за медицински изследвания King Fahd, Университет King Abdulaziz, Джеда, Саудитска Арабия

Yuet-Kin Leung

6 Отдел по генетика на околната среда и молекулярна токсикология, Катедра по екологично здраве, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

7 Център за генетика на околната среда, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

11 Център за рак в Синсинати, Синсинати, Охайо

Майкъл А. Томас

5 Отдел по репродуктивна ендокринология и безплодие, Катедра по акушерство и гинекология, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

Шук-Мей Хо

6 Отдел по генетика на околната среда и молекулярна токсикология, Катедра по екологично здраве, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

7 Център за генетика на околната среда, Медицински колеж на Университета в Синсинати, Синсинати, Охайо

11 Център за рак в Синсинати, Синсинати, Охайо

12 Медицински център на болница за ветерани в Синсинати, Синсинати, Охайо

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Безплодието засяга една от осемте двойки в САЩ, като една трета от тези случаи са без известна етиологична причина [1]. Един от виновниците е неуспехът на имплантацията, който може да представлява 30% от всички загуби в началото на бременността [2, 3]. Нарастват доказателствата, че факторите на околната среда [4–6] и начина на живот като ендокринни разрушители [7, 8] и диета [9] влияят върху имплантирането на ембриони и могат да допринесат значително за безплодие. Бисфенол А (BPA), прототип на ендокринно-разрушаващия химикал (EDC), е повсеместен в нашата среда и 95% от населението на САЩ има откриваемо ниво на урина [10]. Големи количества се синтезират при производството на пластмасови съдове за храни и напитки, водопроводи, банкноти и касови бележки от термохартия [11–14]. Неволното му освобождаване от тези потребителски продукти замърсява храната, водата и телата ни. Тъй като по-високият BPA в урината в диапазона на ниски дози (> 1,243 μg/L) е свързан с множество хронични заболявания [15–20], неговият ефект върху фертилитета на жените по отношение на ранната загуба на ембриони предизвиква голямо безпокойство. В действителност, в кохорта от жени, подложени на ин витро оплождане, по-високите нива на BPA в урината (3.80–26.48 μg/L) корелират с повишен неуспех на имплантацията [21].

Западната диета обикновено е богата на мазнини. Според Министерството на земеделието на САЩ, Службата за селскостопански изследвания диетата се счита за високо съдържание на мазнини, ако> 35% от калориите са от мазнини, докато диетата с ниско съдържание на мазнини е тази, при която 13 C12-BPA (≥99%) е закупен от Кембриджски изотопни лаборатории. β-глюкуронидаза от Helix pomatia (197114 единици/ml β-глюкуронидаза и 876 единици/ml сулфатаза) е закупена от Sigma-Aldrich. Основните разтвори на целевите аналити и вътрешните стандарти се приготвят при 1 mg/ml в метанол и се съхраняват при -20 ° C.

Използваните в експериментите метанол (високоефективна течна хроматография [HPLC]) и етилацетат (клас ACS) са закупени от Mallinckrodt Baker. Водата Milli-Q се пречиства чрез ултрачиста водна система (Barnstead International).

приготвяне на пробата.

LC-ESI (-) MS/MS анализ на BPA.

Осигуряване на качество/контрол на качеството.

Количественото определяне на всички аналити се извършва чрез метод на изотопно разреждане въз основа на отговорите на 13 C12-BPA. Калибрационните стандарти, инжектирани при различни концентрации, вариращи от 0,1 до 10 ng/ml, показват коефициент на регресия ≥0,99. Границите на количествено определяне (0,2 ng/ml) бяха определени въз основа на най-ниската точка на еталона за калибриране и обема на пробата, взета за анализ, и фактора на концентрацията. Като проверка за инструментален дрейф в факторите на реакция се инжектира стандарт за калибриране в средната точка след всеки пет проби. За да се предотврати пренасянето на целевите аналити от проба в проба, се инжектира чист разтворител (метанол) след всеки пет проби.

За измерване както на свободен, така и на общ BPA, бяха анализирани пет процедурни заготовки, за да се определи концентрацията, произтичаща от лабораторни материали и разтворители. Средните нива на BPA, открити в процедурни заготовки, бяха съответно 0,20 и 0,26 ng/ml и тези концентрации бяха извадени от измерените стойности на пробите.

Извличане на ембриони и култура

Преимплантационните ембриони бяха извлечени от промивки на яйцеклетката и матката на 39 плъхове GD4.5 (n = 6–9 плъхове на група) в среда M2 (Sigma) и култивирани до образуване на бластоцисти в 20 μl mR1ECM капчици (Cosmo Bio) съгласно протокола описано [37]. Бяха сравнени местоположението, етапът на развитие и бластулацията на ембрионите от различните групи на лечение.

Анализ на израстването на бластоциста

Анализът за израстване на бластоциста е извършен, както е описано по-горе [38]. Накратко, zona pellucida на бластоцистите на плъхове се разтваря в киселинен тирод (Sigma). След това ембрионите без zona pellucida се култивират върху фибронектинова матрица в продължение на 4 дни в модифицирана от Dulbecco среда на Eagle (Sigma), допълнена с 10% фетален говежди серум (Sigma). Изображенията на израстналите ембриони са заснети ежедневно с обърнат микроскоп (Carl Zeiss Microscopy GmH) с помощта на 20x обектив и са анализирани от AxioVision Microscopy Software (Carl Zeiss). Площта, покрита от ембриона, е записана като зона на израстъци. Израстналите ембриони бяха фиксирани с 4% параформалдехид (v/v) (Sigma) и имунооцветени за актиновия цитоскелет с помощта на маркирано с Alexa Fluor-488 антитяло срещу F-актини (Invitrogen). Флуоресцентните изображения са заснети с помощта на конфокалния микроскоп LSM 710 (Carl Zeiss) с лазерни линии 488nm, 561nm и 633nm.

Оценка на размерите на ембриони GD8

Репродуктивният тракт на 17 плъхове GD8 (п = 3-4 плъхове на група) е събран и дигитално заснет за анализи. Размерът на ембриона, посочен като периметъра на всяко място за имплантиране, е изчислен за всички ембриони (общо 215 ембриони; 9-18 ембриони на плъх) с помощта на микроскоп AxioVision и софтуер за анализ на Image J.

Хистология и имунохистохимия

Маточните тъкани на плъх GD8 бяха фиксирани в 10% формалин, дехидратирани и вградени в парафин. Серийните срезове при 5 μm бяха оцветени с хематоксилин/еозин (Thermo Fisher Scientific) за хистологичен анализ. Имунохистохимичен (IHC) анализ беше извършен на секциите, както е описано по-рано [39], за да се определи експресията на протеин на цитокератин-7 (CK7) и рецептор на епидермален растежен фактор (EGFR). Като имуноглобулинов G-отрицателен контрол се използва нормален серум (Vector Laboratories). Първичните антитела за CK7 (Abcam) и EGFR (Abcam) бяха разредени 1: 100 в блокиращ разтвор. Вторичният кози анти-заешки IgG (Vector Laboratories) се разрежда 1: 200 в блокиращ разтвор.

Статистически анализ

МАСА 1

Ефектът на излагането на мазнини и BPA върху серумните нива на BPA.