Ключова лаборатория за водно хранене и наука за фуражите от провинция Дзянсу, Колеж по животновъдни науки и технологии, Нанкински селскостопански университет, Нанкин, Китай, Ключова лаборатория за използване на сладководен риболов и зародишни плазми, Министерство на земеделието, Изследователски център за сладководно рибарство, Китайска академия на Науки за рибарството, Wuxi, Китай, Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi, Китай

излагането

Ключова лаборатория за водно хранене и наука за фуражите от провинция Дзянсу, Колеж по животновъдни науки и технологии, Земеделски университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за използване на ресурси за сладководен риболов и зародишни плазми, Министерство на земеделието, Изследователски център за сладководни риболовни дейности, Китайска академия по риболовни науки, Уси, Китай, Уси рибарски колеж, Нанкински земеделски университет, Уси, Китай

Ключова лаборатория за водно хранене и наука за фуражите от провинция Дзянсу, Колеж по животновъдни науки и технологии, Земеделски университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за водно хранене и наука за фуражите от провинция Дзянсу, Колеж по животновъдни науки и технологии, Земеделски университет в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за водно хранене и наука за фуражите от провинция Дзянсу, Колеж по животновъдни науки и технологии, Земеделски университет в Нанкин, Нанкин, Китай

  • Дингдонг Джанг,
  • Kangle Lu,
  • Zaijie Dong,
  • Гуанджън Дзян,
  • Уейна Сю,
  • Уенбин Лю

Фигури

Резюме

Цитат: Zhang D, Lu K, Dong Z, Jiang G, Xu W, Liu W (2014) Ефектът от излагането на диета с високо съдържание на мазнини върху експресията на MicroRNA в черния дроб на тъпата муцуна (Megalobrama amblycephala). PLoS ONE 9 (5): e96132. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096132

Редактор: Yanqiao Zhang, Североизточен медицински университет в Охайо, Съединени американски щати

Получено: 9 февруари 2014 г .; Прието: 2 април 2014 г .; Публикувано: 2 май 2014 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националната фондация за природни науки на Китай (Проект 60901053, 31172418 и 31202005), Отворения фонд на ключовата лаборатория за използване на ресурси за сладководен риболов и зародишни плазми, Министерство на земеделието, Изследователски център за сладководно рибарство, Китайска академия по риболовни науки (NO KF201310) и проектите „333“ на провинция Дзянсу. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Тъпата муцуна (Megalobrama amblycephala) е вид риба с висока икономическа стойност, която се отглежда в китайските сладководни поликултурни системи, както и все по-често в други райони на Азия [1]. Според последния годишник на Статистиката за риболова и аквакултурите на ФАО, общият добив на платика с тъпа муцуна в Китай е достигнал 652 215 тона през 2010 г. [2]. Поради растителноядния си инстинкт и сравнително ниското съотношение на теглото на черния дроб към телесното тегло, тъпата муцуна е много податлива на чернодробна стеатоза, когато се храни с високомаслена диета (HFD) с цел пестене на протеини в интензивна културна система. Следователно този вид е полезен модел за изследване на физиологията на липидния метаболизъм и за сравняването му с този на други видове като зебра и медака [3], [4].

Диетичните мазнини включват група водоразтворими молекули, която включва холестерол и триглицериди. Черният дроб синтезира липопротеини и в зависимост от вида е горе-долу епицентърът на синтеза на мастни киселини и липидната циркулация. Натрупването на липидни капчици в хепатоцитите води до чернодробна стеатоза, която може да се развие в резултат на множество дисфункции, като промени в β-окислението, секреция на липопротеини с много ниска плътност и активиране на пътища, участващи в синтеза на мастни киселини [5], [6]. Множество чернодробни транскрипционни фактори, включително чернодробни X рецептори [7], ретиноидни X рецептори [8], ядрени фактори на хепатоцитите [9], активирани пероксизомни пролифераторни рецептори (PPARα, β и γ) [10], свързващ протеин свързващ елемент на cAMP [ 11], стерол-регулаторни свързващи елементи протеини [12] и CCAAT/енхансер-свързващи протеини [13], контролират генни мрежи, които управляват липидния синтез, катаболизъм, съхранение и секреция. Наскоро микроРНК (miRNAs) се появиха като критични регулатори на генната експресия, които контролират чернодробния липиден метаболизъм на посттранскрипционно ниво [14].

Материали и методи

Декларация за етика

Всички експериментални протоколи са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните от Земеделския университет в Нанкин (Нанкин, Китай). За събиране на тъкани рибите се упояват в добре аерирана вода с 0,01% трикаин метансулфонат (Sigma, Сейнт Луис, САЩ) и се жертват според Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни от Китай.

Експериментално изпитание с риба и хранене

Младежка тъпа муцуна платика, събрана от люпилнята на Ухан (Хубей, Китай), се отглежда в рециркулираща система за аквакултури. След седмица на аклимация 200 здрави риби (тегло: 20,24 ± 0,11 g) бяха разделени на случаен принцип в групите NFD (5% мазнини) и HFD (15% мазнини диета) (n = 100 на група). Във всеки резервоар от 480 L се помещават 25 риби. Рибите са хранени на ръка до видимо насищане три пъти на ден (6: 00–6: 30, 12: 00–12: 30 и 18: 00–18: 30). Тъпата муцуна се поддържа в контролирана среда с 12/12-часов цикъл светлина-тъмнина при 28 ° C. Формулирането на експерименталните диети и предпочитанията за качество на околната среда са взети от установени протоколи [26], [27]. Всяка диета беше тествана в четири повторни резервоара и изпитанието продължи осем седмици.

Вземане на проби и извличане на РНК

След осем седмици отглеждане чернодробните тъкани се отстраняват от рибите, незабавно се замразяват в течен азот и след това се съхраняват при -80 ° C до употреба. За последователността на miRNA бяха избрани общо 16 риби (валидирани чрез оцветяване с маслено червено О; виж по-долу) от две групи (по един мъж и жена от всеки от осем резервоара). Общата РНК беше извлечена с помощта на микроРНК изолационен комплект mirVana (Ambion, Austin, USA), съгласно инструкциите на производителя. Качеството и количеството на общата РНК се определят с помощта на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent, Калифорния, САЩ). РНК проби с РНК номер на интегритет> 8.0 бяха обработени за секвениране. 8 РНК проби от група NFD с еквивалентна концентрация на РНК и 8 проби от РНК от група HFD с еквивалентна концентрация на РНК бяха събрани заедно за секвениране, съответно.

Маслено червено O оцветяване

След трикратно измиване с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, нарязаните чернодробни проби се фиксират с 10% формалин във фосфатен буфер за 1 h при стайна температура. След това пробите се измиват с буфериран с фосфат физиологичен разтвор и се оцветяват с филтриран маслено червен разтвор на О (Sigma-Aldrich) (0,5 g в 100 ml изопропилов алкохол) в продължение на 15 минути при стайна температура. След оцветяването пробите се изплакват два пъти с дестилирана вода за 15 минути. Разрезите също бяха оцветени с хематоксилин на Mayer, за да се визуализират ядрата [4].

Подготовка и секвениране на малка РНК библиотека

Малки РНК (16–30 nt) бяха изолирани от общите проби на РНК чрез фракциониране по размер, използвайки 15% денатурираща полиакриламидна гел електрофореза. След това собствени адаптери (Illumina, San Diego, USA) бяха лигирани към 5 'и 3' края на малките РНК и беше извършена обратна транскрипция съгласно протокола Illumina. Генерираните малки cDNA библиотеки бяха амплифицирани чрез PCR, използвайки праймери, допълващи адаптерните последователности. След това библиотеките на cDNA бяха дълбоко секвенирани, използвайки системата HiSeq2000 (Illumina, Сан Диего, САЩ) в Пекинския институт за геномика (Шенжен, Китай), съгласно инструкциите на производителя. Всички малки данни за RNA и RNASeq са налични в NCBI SRA (Sequence Read Archive) под присъединяване SRX494382 и SRX494377 съответно.

Анализ на последователността и идентификация на miRNA

Диференциален експресионен анализ на данните за последователността

За да се сравнят нивата на експресия на miRNAs в cDNA библиотеките, приготвени от NFD и HFD групите, данните за секвениране бяха нормализирани, както следва:. Ако нормализираната експресия на дадена miRNA беше нула, стойността на нейната експресия беше зададена като 0,01. В допълнение, miRNAs с нормализирани стойности на експресия. P-стойностите са генерирани от нормализираните стойности на израза, както е показано по-долу [29], където N1 и N2 представляват общия брой чисти четения съответно в библиотеките HFD и NFD, а x и y представляват нормализираното ниво на изразяване на дадена miRNA съответно в библиотеките HFD и NFD:

Количествен PCR анализ в реално време

Обратната транскрипция на miRNAs беше извършена с помощта на miRNA-специфични праймери на стволови цикли и PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio, Dalian, Китай). Всяка 20 µl реакция съдържа 1 µl PrimeScript RT Enzyme Mix I, 4 µl 5 × PrimeScript буфер, 6 µl вода без нуклеаза, 5 µl РНК шаблон и 4 µl праймер на стволови цикли (Таблици S1 и S2) . Обратната транскрипция се извършва чрез инкубиране на реакциите при 16 ° С за 30 минути, 42 ° С за 30 минути и след това 85 ° С за 5 минути. PCR амплификация в реално време се извършва с помощта на SYBR Premix EX Taq II Kit (Takara Bio, Dalian, Китай). Всяка 25 µl реакция включваше 1,3 µl сДНК матрица, 12,5 µl SYBR Premix EX Taq II, 1 µl специфичен за miRNA праймер (10 µM), 1 µl универсален обратен праймер (10 µM) и 9,2 µl RNase- безплатна вода. Термичното циклиране се извършва на 7900HT бърза PCR система в реално време (Applied Biosystems, Foster, USA), както следва: 95 ° C за 10 минути, последвано от 40 цикъла от 95 ° C за 30 s, 60 ° C за 30 s, и 72 ° С за 45 s. След усилване беше извършена програма за крива на топене. Данните бяха анализирани чрез сравнителния CT метод [△ CT = CT (miRNA) - CT (Rpl13a)], като се използва експресия на Rpl13a като ендогенна референция [30], [31].

Относителната експресия на миРНК целеви гени се определя с помощта на PrimeScript RT Master Mix Kit и SYBR Premix Ex Taq II Kit (Takara Bio, Dalian, Китай). PCR протокол в реално време е стартиран при 95 ° C за 10 минути, последван от 40 цикъла на двустепенна програма за усилване (15 s при 95 ° C; 40 s при 60–62 ° C), в съответствие с използвания набор от грундове (Таблица S3). Кривите на топене се наблюдават систематично в края на последния цикъл на усилване, за да се потвърди специфичността на реакцията на усилване. Данните бяха анализирани чрез сравнителния CT метод [△ CT = CT (mRNA) - CT (ACTB)], като се използва ACTB експресия като ендогенна референция.

Прогнозиране и анализ на целеви гени на miRNA

Целеви гени на диференциално експресирани miRNAs бяха идентифицирани с помощта на пакетите за прогнозиране RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid) и TargetScan (http://www.targetscan.org/). Критериите, използвани за прогнозиране на целта, бяха следните: (i) не повече от четири несъответствия между малката РНК и целта (GU бази се отчитат като 0,5 несъответствия), (ii) не повече от две съседни несъответствия в miRNA/целевия дуплекс, (iii) липсват съседни несъответствия в позиции 2–12 от miRNA/целевия дуплекс (5 ′ край на miRNA), (iv) няма несъответствия в позиции 10–11 от miRNA/целевия дуплекс, (v) не повече от 2,5 несъответствия в позиции 1–12 на miRNA/целевия дуплекс (5 ′ край на miRNA) и (vi) минимална свободна енергия (MFE) на miRNA/целевия дуплекс ≥75% от MFE на miRNA, свързана с неговия перфектен допълнение. Целевите гени, свързани с липидния метаболизъм, които бяха идентифицирани както от RNAhybrid, така и от TargetScan и които присъстваха в резултатите от нашия анализ на сравнителен транскриптомен секвенционен анализ на M. amblycephala (данни не са показани), бяха разгледани за допълнително изследване. Функции, които бяха значително свързани с предсказаните целеви гени на miRNAs, бяха определени чрез анализ на биологичния процес на GO (http://www.geneontology.org) и анализ на пътя на KEGG (http://www.genome.jp/kegg/ pathway.html).

Резултати и дискусия

Чернодробно натрупване на липиди в HFD-хранена и NFD-хранена тъпа муцуна платика

Излагането на HFD може да се използва за индуциране на чернодробна стеатоза при животински модели [26]. За да се изследва липидният метаболизъм и да се идентифицират miRNAs, свързани с чернодробната стеатоза, тъпата муцуна е била хранена с HFD или NFD в продължение на осем седмици. Маслено червено O оцветяване на проби от чернодробна тъкан разкрива наличието на тежко чернодробно натрупване на липиди при риби, хранени с HFD, но не и при риби, хранени с NFD (фигури 1А и 1В).