Резюме
Въведение
Материали и методи
Животни
40 здрави мъжки SD плъхове (Slack компании, номер на лиценз: SCXK (Shanghai) 2012-0002) са отбити (на възраст 6-7 седмици), претеглени (220 g ± 25 g); и произволно разделени на контролна група (нормална диета) и експериментална група (диета с високо съдържание на мазнини). Тези плъхове бяха отгледани в клетки, класифицирани по SPF, 3-8 плъхове на клетка, а храната, водата, постелката и клетките бяха стриктно стерилизирани чрез стандартен протокол, прегледан и одобрен от Комитета по животните. Светлината се даваше в цикъл от 12 часа ярка и 12 часа нощ и тези плъхове бяха свободни както за храна, така и за вода.
Диети
Нормалната диета, използвана в този експеримент, е синтетичната диета, която съдържа достатъчно хранителни вещества и енергия, за да отговори на изискванията за растежа и развитието на плъховете. В допълнение, диета с високо съдържание на мазнини беше изпълнена въз основа на нормалната диета чрез коригиране на дела на мазнините и нишестето. Нормалната диета се осигурява от Slack Company със съотношение, включващо 28% протеини, 12% мазнини и 60% въглехидрати. А диетата с високо съдържание на мазнини се предлага и от Slack Company със съотношение, включващо 20% протеини, 60% мазнини и 20% въглехидрати (Таблица 1).
маса 1
Съотношения на хранителни вещества и калории при нормална диета и диета с високо съдържание на мазнини
| Нормална диета | Съотношения на хранителни вещества | 30 | 5.7 | 64.3 |
| Съотношения на калории | 28 | 12 | 60 | |
| Диета с високо съдържание на мазнини | Съотношения на хранителни вещества | 30 | 40 | 30 |
| Съотношения на калории | 20. | 60 | 20. |
Създаване на модели със затлъстели плъхове
40 мъжки SD плъхове бяха разделени на нормална диета и група с високо съдържание на мазнини, хранени съответно с нормална диета и диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 8 седмици. Всяка седмица тези плъхове се претеглят, измерват дължината и се наблюдават характеристики на психичните състояния, приема на вода, обема на урината, апетита, изпражненията, яркостта на косата и козината и очите. Моделиране на критерии за оценка: плъхове с тегло 20% повече от стандартното тегло се считат за отговарящи на стандарта за затлъстяване. След 4 седмици беше взета кръв от вените на опашката, за да се изследват липидите в кръвта, кръвната захар и други показатели. След 8 седмици плъховете бяха жертвани за събиране на орбитална кръв, тестване на серумни липиди и нива на глюкоза в кръвта. Теглото на плъховете се измерва с електронни везни за претегляне на животни, а мастната мастна тъкан се поддържа и измерва с електронни аналитични везни и се съхранява при -80 ° C течен азот.
MicroRNA микрочипове
МикроРНК чипът е предоставен от Шанхай Kangcheng Bioingineering Company. Общата РНК в мастната мастна тъкан се отстранява от реактива Trizol (Invitrogen Corporation), съгласно техните инструкции, и се тества чрез ултравиолетова абсорбционна спектрометрия и деформационна електрофореза в агарозен гел. Освен това микроРНК бяха маркирани от miRCURY ™ Array Labeling Kit според техните инструкции, концентрирани от RNeasyMini Kit според техните инструкции и хибридизирани от miRCYRY ™ Array Microarray Kit и Hybridization Chamber IIKit според техните инструкции. И накрая, изображенията бяха сканирани от Gene-pix 4 000 B, вълнуващи с дължина на вълната на светлината 635 nm, запазени като r11F файлове и анализирани от Genepix Pro 6.0. Счита се за значителна тенденция към възходяща или низходяща тенденция, когато стандартната стойност на групата с високо съдържание на мазнини е по-висока от 2 пъти или по-малка от 0,5 пъти в сравнение с нормалната диетична група.
PCR проверка в реално време
Общата РНК беше извлечена съгласно инструкциите: последователностите и условията на реакция на PCR праймерите за синтез на cDNA бяха посочени в Таблица 2 .
Таблица 2
Последователности на праймера и реакционни условия
| микроРНК-17 | 5-ACAGCAGAGAAGGCACAAGAGG-3 | 22. | 60.09 |
| микроРНК-342 | 5-AGGGGAGCAAACAGAGAAAGAG-3 | 22. | 59,97 |
| микроРНК-92а | 5-AAAAGCACAAGACCCGGCCAG-3 | 21. | 59,97 |
| микроРНК-382 | 5-GAAGAAGAACGAGGAGGAAACG-3 | 22. | 59,97 |
| микроРНК-30с | 5-AGAAAACAACCAACACACACAGC-3 | 23. | 59,97 |
| микроРНК-30а | 5-CAAACAGACGGAAGAAAGCAGC-3 | 22. | 60.04 |
| микроРНК-139 | 5-ACAACAGAGCACGAGACACCAG-3 | 22. | 60.04 |
| микроРНК-335 | 5-ACAAGAGCAAAAACGAAAAAAGA-3 | 23. | 60.04 |
| GAPDH | 5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3 | 101 | 62,00 |
| 5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 | 62,90 |
Протеин, тестван от Western-Blot
Протеинът на плъхове се екстрахира, концентрира и тества по методи, включващи: SDS-PAGE електрофореза; протеин прехвърлен; изобразяване на протеини; имуноанализ; и откриване на хемилуминесценция.
Анализ на данни
Таблица 3
Сравнение на телесното тегло и дължината на плъховете
| Телесно тегло | |||
| Нормална диета | 244,55 ± 8,73 | 320,22 ± 5,05 | 385,92 ± 26,52 |
| Диета с високо съдържание на мазнини | 246,56 ± 6,02 | 351,72 ± 5,99 | 473,25 ± 48,5 * |
| Височина | |||
| Нормална диета | 18,94 ± 1,73 | 23,17 ± 1,38 | 25,679 ± 1,31 |
| Диета с високо съдържание на мазнини | 18,72 ± 1,45 | 25,06 ± 1,08 | 28,89 ± 1,90 |
Таблица 4
Теглото на ометалните мазнини се променя в групата с високо съдържание на мазнини след хранене в продължение на 8 седмици
| Тегло на мастната тъкан (g) | 13,61 ± 1,20 | 30,11 ± 1,60 * |
Таблица 5
Нива на липидите, включително триглицериди и др., Сравнени и в двете групи
| Триглицериди | 0,94 ± 0,12 | 0,99 ± 0,09 | 1,68 ± 0,16 | 2,05 ± 0,11 | 2,00 ± 0,14 | 3,17 ± 0,19 * |
| Общ холестерол | 2,38 ± 0,1 | 2,42 ± 0,11 | 2,88 ± 0,08 | 3,46 ± 0,14 | 3,75 ± 0,12 | 4,20 ± 0,15 * |
| Липопротеин с висока плътност | 1,11 ± 0,13 | 1,17 ± 0,26 | 1,02 ± 0,15 | 0,94 ± 0,14 | 0,83 ± 0,18 | 0,54 ± 0,19 * |
| Липопротеин с ниска плътност | 1,07 ± 0,10 | 1,05 ± 0,22 | 1,52 ± 0,11 | 1,82 ± 0,11 | 2,72 ± 0,10 | 3,02 ± 0,07 * |
Нивата на инсулин се повишават преди и 8 седмици след нормална или богата на мазнини диета. * P Фигура 2). В сравнение с нормалната диетична група, мастните клетки на плъхове в групата с високо съдържание на мазнини са по-пълни, закръглени и плътни.
Мастни клетки с маслено червено оцветяване в нормална диета и група с високо съдържание на мазнини. В сравнение с нормалната диетична група (A), мастните клетки на плъхове в групата с високо съдържание на мазнини (B-D) бяха по-пълноценни, закръглени и плътни.
Експресия на микроРНК
МикроРНК в мастната мастна тъкан на плъхове са идентифицирани и проверени чрез методи на микроРНК микрочипове и PCR в реално време. При плъхове със затлъстяване, сред общо 468 вида микроРНК, 13 се експресират диференцирано, включително 7 регулирани нагоре микроРНК (microRNA30a, microRNA7e, microRNA30c, microRNA335, microRNA103, microRNA107, microRNA139-5p) и 6 регулирани надолу микроРНК (microRNA494, microRNA microRNA342-5p, microRNA382, microRNA17-1-3p, microRNA92a) (Таблица 6).
Таблица 6
Промяна на експресията на микроРНК при затлъстели плъхове
| Регулирани нагоре микроРНК | микроРНК30а | 3,17 ± 0,38 | 0,039 |
| microRNA7e | 2,68 ± 0,24 | 0,038 | |
| микроРНК30с | 1,72 ± 0,12 | 0,038 | |
| микроРНК335 | 2,23 ± 0,15 | 0,037 | |
| микроРНК139-5р | 4,54 ± 0,67 | 0,009 | |
| Регулирани надолу микроРНК | микроРНК494 | 0,76 ± 0,11 | 0,044 |
| микроРНК140 | 0,67 ± 0,06 | 0,044 | |
| микроРНК342-5р | 0,42 ± 0,08 | 0,027 | |
| микроРНК382 | 0,31 ± 0,07 | 0,024 | |
| микроРНК17-1-3р | 0,58 ± 0,04 | 0,023 | |
| микроРНК92а | 0,38 ± 0,13 | 0,018 |
Дискусия
За изследване на човешкото затлъстяване са установени много животински модели, включително модел на затлъстели плъхове с високо съдържание на мазнини и високоенергийна храна, което е в съответствие с патогенезата на човешкото затлъстяване [17]. Понастоящем няма доклади за скрининг на микроРНК чрез методи с микрочипове, за да се идентифицира диференциалната експресия на микроРНК в мастната тъкан при затлъстели плъхове. Напоследък много изследвания се фокусират върху функцията на микроРНК при много заболявания, което се превръща в гореща точка за изследване на патогенезата. Настоящите изследвания обаче са само върхът на айсберга, така че все още има много нерешени проблеми. MicroRNA е общопризната като нова регулаторна молекула, засягаща различни биологични функции, но няма достатъчно доказателства, за да докаже, че има пряка роля в регулирането при затлъстяване и е свързана с инсулинова чувствителност или диабет тип 2 и коронарни сърдечни заболявания [18-20].
Целта на нашето изследване беше да се определи дали експресионната карта на микроРНК се различава в присъствието или отсъствието на затлъстяване. Чрез хранене с високо съдържание на мазнини се установяват модели на затлъстели плъхове, в сравнение с нормалната диетична група, мастните показатели се променят в групата с високо съдържание на мазнини, включително повишено телесно тегло, тегло на мастната тъкан, триглицериди, общ холестерол, липопротеин с ниска плътност, кръвна глюкоза ниво и ниво на инсулин, и намален липопротеин с висока плътност, и диференциален фенотип на мастните клетки. Освен това, чрез техники с микрочипове и PCR в реално време са идентифицирани 13 микроРНК с диференциална експресия, включително 7 регулирани нагоре микроРНК (microRNA30a, microRNA7e, microRNA30c, microRNA335, microRNA103, microRNA107, microRNA139-5p) и 6 регулирани надолу микроРНК (microRNA494, microRNA140, microRNA342-5p, microRNA382, microRNA17-1-3p, microRNA92a). И накрая, всички резултати, доказани в нашето проучване, ще помогнат за по-доброто разбиране на механизма на регулиране на растежа на мастните клетки, за да се знае ролята на микроРНК при плъхове със затлъстяване и за поставяне на основи за по-нататъшни проучвания върху индуцирани от mciroRNA нарушения на липидния метаболизъм.
- Пълна статия Пери-адипоцитен ECM ремоделиране при затлъстяване и фиброза на мастната тъкан
- Профилиране на генна експресия в подкожни, висцерални и епигастрални мастни тъкани на пациенти с
- Безплатни пълноценни секс разлики в клетките в черния дроб, мастната тъкан и мускулната транскрипция
- Намаляване на регулирането на трафика на мастни киселини в мастна тъкан при диабет със затлъстяване
- Храната активира кафявите мазнини Как кафявата мастна тъкан реагира на богата на въглехидрати храна - ScienceDaily