Джи Йънг Юнг

1 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodeamun-gu, Сеул 120-750, Република Корея

Йени Лим

1 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodeamun-gu, Сеул 120-750, Република Корея

Мин Слънце Луна

1 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodeamun-gu, Сеул 120-750, Република Корея

Джи Йон Ким

1 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodeamun-gu, Сеул 120-750, Република Корея

Оран Куон

1 Катедра по хранителна наука и управление на храните, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodeamun-gu, Сеул 120-750, Република Корея

Резюме

Заден план

Производните на кверцетин в лука се считат за най-важните флавоноиди за подобряване на диабетичния статус в клетките и животинските модели. Настоящото проучване имаше за цел да изследва хипогликемичния и инсулиносенсибилизиращия капацитет на екстракта от лукова кора (OPE), съдържащ високо кверцетин в диети с високо съдържание на мазнини/индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове, и да изясни механизма на неговия инсулиносенсибилизиращ ефект.

Методи

Мъжки плъхове Sprague-Dawley са хранени с диетата AIN-93G, модифицирана да съдържа 41,2% мазнини, и интраперитонеално инжектирани с единична доза стрептозотоцин (40 mg/kg телесно тегло). Една седмица след инжектирането, плъховете с нива на кръвната захар на гладно над 126 mg/dL бяха разделени на случаен принцип в 4 групи за лечение с диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща 0 (диабетна контрола), 0,5 или 1% от ОПЕ или 0,1% кверцетин (еквивалент на кверцетин) до 1% от OPE) за 8 седмици. За да се изследва механизмът за ефектите на ОПЕ, ние изследвахме биохимични параметри (инсулинова чувствителност и оксидативен стрес) и протеинови и генни експресии (провъзпалителни цитокини и рецептори).

Резултати

В сравнение с диабетичния контрол, хипогликемичната и инсулино-сенсибилизиращата способност на 1% OPE са демонстрирани чрез значително подобрение на толерантността към глюкозата, изразена в нарастваща площ под кривата (P = 0,0148). Инсулиносенсибилизиращият ефект на ОПЕ се подкрепя допълнително от повишени нива на гликоген в черния дроб и скелетните мускули (Р Ключови думи: Екстракт от лукови кори, кверцетин, диабет тип 2, стрептозотоцин, антиоксидант

Заден план

Захарният диабет тип 2 (T2DM) е едно от най-често срещаните хронични заболявания в света, тъй като промяната на начина на живот води до намалена физическа активност и повишено затлъстяване [1]. Ранният феномен на T2DM е инсулиновата нечувствителност, която не само има отрицателни метаболитни последици [2-5], но също така допринася за последващо изтощение на бета-клетки на панкреаса, което води до появата на клинична хипергликемия [6]. По този начин разбирането на регулирането на инсулиновия отговор и идентифицирането на свързаните механизми са важни за ранното лечение и профилактика на T2DM. Предложени са няколко хипотези за обяснение на патогенезата на T2DM и през последните десетилетия много внимание се отделя на липидната токсичност и нискостепенното възпаление като основни причини за инсулиновата нечувствителност [7,8].

Предложени са редица начини за подобряване на инсулиновата чувствителност, тъй като ранното лечение и профилактика играят ключова роля за намаляване на популационната тежест на диабета. Промените в начина на живот като отслабване, упражнения и спазване на диетата често се препоръчват, но са били трудни за поддържане в дългосрочен план. Препоръчват се предимствата на фармацевтичните фактори за лечение на агресивно рано, но лекарствата могат да имат нежелани странични ефекти. По този начин нараства интересът към билковите лекарства, които могат да бъдат въведени в общата популация с най-малко странични ефекти и максимален превантивен резултат [9]. В този контекст флавоноидите, които се срещат естествено в растителните храни, биха били желателни варианти. Много проучвания показват, че диабетът може да бъде забавен или предотвратен чрез намеса с диетични флавоноиди. Кверцетинът е един от най-често срещаните флавоноиди в храните и се съобщава, че подобрява диабетичния статус чрез намаляване на оксидативния стрес [10-12] или чрез намаляване на нарушенията на чернодробната генна експресия [13]. Повечето от проучванията обаче обикновено се провеждат с помощта на пречистен кверцетин, а не на хранителни екстракти, обогатени с кверцетин.

Луковите луковици са признати за най-богатия източник на диетични флавоноиди. Описани са поне 25 различни флавоноида, а кверцетинът и неговите гликозиди са най-важните [14]. Особено по-високи концентрации на кверцетин се срещат във външните сухи слоеве на луковицата [15]. В предишното проучване нашият екип показа, че външните сухи слоеве лукова луковица имат силна антиоксидантна активност и предложи кверцетин като основен компонент, отговорен за тази активност [16]. Въпреки че има няколко проучвания, представени антидиабетни ефекти на екстракта от лучена кожа in vivo [17,18], са необходими повече доказателства в подкрепа на неговите способности за сенсибилизиране на инсулина. Следователно настоящото проучване е проведено, за да се оцени ефективността на OPE за модулиране на хипергликемия и нечувствителност към инсулин чрез използване на диетичен модел на плъхове, индуциран от високо съдържание на мазнини (HFD)/стрептозотоцин (STZ). Ефектът на OPE върху плазмената концентрация на FFA, биомаркерите на оксидативен стрес и възпаление в черния дроб, инсулиновия рецептор (INSR) и експресиите на глюкозен транспортер тип 4 (GLUT4) в скелетните мускули също са изследвани.

Материали и методи

Подготовка на ОПОС

ОПОС беше любезно предоставен от Центъра за биоиндустрия на лука Чангниеонг (Чангвон, Корея). Накратко, външните сухи слоеве лукови луковици (Allium cepa L.) се екстрахират с 60% етанол, коригиран до рН 5,5 при 50 ° С за 3 часа. Екстрактът беше концентриран и след това лиофилизиран. Количеството на общия полифенол и кверцетин е 618,10 ± 14,51 mg/g и 101,28 ± 6,95 mg/g, както е определено чрез методи на Folin-Ciocalteu [19] и Hertog et al. [20], съответно. Чистият кверцетин е закупен от Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Осака, Япония).

Животни, индукция на диабетици и диети

Тест за орален глюкозен толеранс

След гладно в продължение на 12 часа на животните се прилага глюкоза (1 g/kg телесно тегло), разтворена във вода чрез сонда. Концентрациите на кръвната глюкоза се определят от опашната вена с Accu-check на 0, 30, 60, 90 и 120 минути. Инкрементната площ под кривата (IAUC) беше изчислена по метода на Thomas MS Wolever et al. [21].

Измерване на плазмения инсулин и свободната мастна киселина

Плазменият инсулин и FFA се измерват с търговски комплекти (комплект за инсулин за плъх ELISA, Mercodia, Упсала, Швеция; комплект за количествено определяне на FFA, Biovision, Mountain view, CA, USA). Всички процедури бяха извършени в съответствие с инструкциите на производителя. Оценката на модела на хомеостазата - инсулинова резистентност (HOMA-IR) беше изчислена за измерване на инсулиновата чувствителност на плъховете, хранени с експериментални диети, по следната формула [22,23]: [Плазмен инсулин на гладно (μg/L) × Глюкоза на гладно (mg) /dL)]/22.5.

Измервания на синтеза на гликоген

Гликогенът в черния дроб и скелетните мускули се определя по метода, описан от LO et al [24]. Накратко, пробите се хомогенизират в разтвор на КОН и се инкубират във вряща вода за 30 минути. След добавяне на 90% етанол те се инкубират една нощ при 4 ° С, последвано от центрофугиране при 1000 g в продължение на 30 минути при 4 ° С (H50A-8 центрофуга, Hanil, Сеул, Корея). Към стандарт и проби се добавят вода, 5% фенолен реагент и разтвор на H2SO4. Гликоген от говежди черен дроб (Sigma Chemical Co., Сейнт Луис, Мисури, САЩ) беше използван като стандарт. Абсорбцията при 490 nm се определя с помощта на спектрофотометър (Genesys 10UV, Thermo Electron Co., Madison, WI, USA).

Измервания на чернодробни маркери на оксидативен стрес

Активността на чернодробния малондиалдехид (MDA) и супероксиддисмутазата (SOD) се измерват, като се използва търговски комплект, закупен съответно от Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) и Dojindo Lab (Kumamoto, Japan). За MDA черният дроб се хомогенизира в 250 μl радиоимунопреципитационен буфер, съдържащ протеазен инхибитор, и се обработва с ултразвук в продължение на 15 секунди при 40 V. След центрофугиране при 1600 g в продължение на 10 минути при 4 ° C, супернатантата се събира за измерване на концентрацията на MDA в съответствие с инструкциите на производителя . За активността на SOD черният дроб се хомогенизира в 10 обема (w/v) 50 mM фосфат - 0.25 M захароза - 0.5 mM EDTA буфер (рН 7.4). Хомогенатът се центрофугира при 10 000 g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Пет милилитра от супернатантата бяха ултразвукови два пъти за 30 секунди. След това се прибавят 2 ml разтвор, съдържащ пет обема хлороформ с три обема етанол и се разбъркват силно в продължение на 2 минути. Сместа се центрофугира при 20 000 g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Крайната супернатанта беше събрана и измерена за активност на SOD в съответствие с инструкциите на производителя.

Уестърн блотинг

Равни количества от целия лизат на черния дроб се разделят чрез SDS-полиакриламиден гел електрофореза, прехвърлят се в мембрани от поливинилиден дифлуорид, инкубират се в блокиращ буфер и се третират с първични антитела: антитуморен некротичен фактор (TNF) -α (Abcam, Cambridge, UK), анти-интерлевкин (IL) -6 (Abcam, Cambridge, UK) и анти-α-тубулин (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Използвани бяха подходящи вторични антитела и лентите бяха визуализирани с помощта на ChemiDoc XRS System и анализирани с помощта на софтуера Quantity One (Bio-Rad, Калифорния, САЩ).

Количествен анализ на обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR) в реално време

Общата РНК беше извлечена от черния дроб или скелетната мускулатура, използвайки реактив TRIZOL (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA). Концентрацията и качеството на РНК се измерват с BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Токио, Япония). cDNA е конструирана, използвайки РНК с голям капацитет с cDNA комплект (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Експресията на иРНК се измерва чрез PCR, използвайки метода TaqMan и система ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Праймерите за целеви гени при плъховете бяха INSR [Insr; Rn01637243_m1], GLUT-4 [Slc2a4; Rn00562597_m1], TNF-a [Tnf; Rn99999017_m1], IL-6 [Il6; Rn01410330_m1] и β-актин [Actb; Rn00667869_m1]. Относителните количества на тези иРНК се нормализират до количеството на β-актин.

Статистически анализ

Всички резултати са представени като средна стойност ± стандартна грешка (SE). Статистическите анализи бяха проведени с помощта на SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Анализите на данните бяха извършени чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с тест за множество сравнения post hoc Dunnet. Статистическата значимост е посочена от Р (Фигура 1А). 1А). Разликата между диабетичната контрола и групата, лекувана с 1% OPE, беше незначително значима във времеви точки 60 минути (P = 0.0597). Както е показано на Фигура Фигура 1В, 1В, в сравнение с диабетната контрола, плъхове с 1% приложение на OPE показват значително намалена IAUC (P = 0,0148), докато групата, еквивалентна на кверцетин, не показва значително намаляване. HOMA-IR, FBG и секрецията на инсулин показват незначително намаляване при всички лечения (Фигура (Фигура 2). 2). Също така няма разлики в телесното тегло, приема на храна и теглото на органите между групите (данните не са показани).

кори

В заключение, настоящото проучване демонстрира способността на OPE да подобрява хипергликемията и инсулиновата резистентност при диабетични плъхове. OPE модулира усвояването на глюкозата и метаболизма в периферните тъкани чрез експресия на гена INSR и GLUT4 в скелетните мускули. Освен това, OPE понижава плазмените нива на FFA и потиска оксидативния и възпалителен стрес в черния дроб. Тези открития осигуряват основа за използването на лукова кора и също имат важни последици за профилактиката и ранното лечение на T2DM.

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

Принос на авторите

JYK и OK са проектирали това изследване; JYJ, YL и MSM проведоха изследвания; JYJ, JYK и OK написаха статията; и JYK и OK имаха основна отговорност за окончателното съдържание. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Благодарности

Благодарни сме на професор Йонг-Джун Ча от Националния университет в Чангвон за любезното предоставяне на ОПОС и за полезни дискусии. Този проект беше подкрепен от Министерството на знанието и икономиката (програма RITD, проект № 70004683) и Министерството на образованието, науката и технологиите (Brain Korea 21, проект № 2006-0519-4-7).