Бруна Кели Соуса Хирата

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Бразилия

инсулиновата

Рената Манчини Банин

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Бразилия

Ana Paula Segantine Dornellas

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Бразилия

Ирасема Сена де Андраде

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Бразилия

Джулиана Коста Силва Земдегс

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Бразилия

Лучана Чагас Каперуто

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Бразилия

Лила Мисае Ояма

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Бразилия

Елиане Бералди Рибейро

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Бразилия

Моника Маркис Телес

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Бразилия

Резюме

Поради високата честота и тежест на затлъстяването и свързаните с него разстройства, е много желателно да се разработят нови стратегии за лечение или дори да се предотврати развитието му. По-рано описахме, че екстрактът от гинко билоба (GbE) подобрява инсулиновата резистентност и намалява наддаването на телесно тегло при затлъстели плъхове. В настоящото проучване имахме за цел да оценим ефекта на GbE както върху възпалителната каскада, така и върху инсулиновата сигнализация при ретроперитонеално мастно депо на плъхове, индуцирани от диета. Плъховете са хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 2 месеца и след това в продължение на 14 дни са третирани с 500 mg/kg GbE. След това плъховете бяха евтаназирани и пробите от ретроперитонеалното депа за мазнини бяха използвани за вестерн-блотинг, RT-PCR и ELISA експерименти. Лечението с GbE насърчава значително намаляване както на приема на храна/енергия, така и на наддаването на телесно тегло в сравнение с нелекуваните затлъстели плъхове. В допълнение, значително увеличение на експресията на Adipo R1 и IL-10 на гена и IR и Akt фосфорилиране също беше наблюдавано, докато NF-κB p65 фосфорилирането и нивата на TNF-α бяха значително намалени. Нашите данни предполагат, че GbE може да има потенциал като терапия за лечение на метаболитни заболявания, свързани със затлъстяването, със специален интерес за лечение на пациенти със затлъстяване, устойчиви на спазване на хранителна образователна програма.

1. Въведение

Честотата на затлъстяване и наднормено тегло драстично се увеличава по целия свят. През 2008 г. 35% от световното население е с наднормено тегло, докато 11% са със затлъстяване [1]. Освен това се изчислява, че затлъстяването ще достигне една трета от населението през 2030 г. [2]. Тази перспектива е особено тревожна, тъй като затлъстяването е свързано с хронични съпътстващи заболявания, като инсулинова резистентност, диабет тип 2 (T2D), субклинично възпаление и други [3].

Предполага се, че консумацията на диета с високо съдържание на мазнини е пряко свързана с патогенезата на затлъстяването, тъй като засяга или централния контрол на приема на храна, и периферния метаболизъм, което води до повишено наддаване на телесно тегло, инсулинова резистентност и други метаболитни нарушения [4, 5] . По този начин ние по-рано демонстрирахме, че продължителното поглъщане на хиперлипидна диета насърчава при плъхове значително повишаване на телесното затлъстяване, триацилглицерол и глюкозните плазмени нива със съпътстваща загуба на инсулинова чувствителност [6].

Инсулиновата резистентност е хронично състояние, при което хормонът инсулин не успява да активира собствената си сигнална каскада, което води до хипергликемия. Той е силно корелиран с излишъка на висцерална затлъстяване и повишената експресия на бяла мастна тъкан (WAT) на цитокини, като фактор на туморна некроза-алфа (TNF-α) и интерлевкин-6 (IL-6) [3, 7]. Освен това приемът на диета с високо съдържание на мазнини е посочен като важен рисков фактор за инсулиновата резистентност, тъй като едновременно нарушава инсулиновия път на сигнализиране и стимулира възпалението чрез каскада от сигнали, подобни на Toll [5, 7, 8].

Като се има предвид, че повечето хипоглицемианти имат нежелани странични ефекти [9–12] и поради тежестта на прогресията на инсулиновата резистентност е много желателно да се открият нови лекарства и методи на лечение. Предполага се, че екстрактът от гинко билоба (GbE) може да има положителни ефекти върху хипергликемията. Този растителен екстракт съдържа предимно около 24% флавоноидни гликозиди и 6% терпеноиди, включително A, B, C, M, J, P и Q гинколиди [13].

По-рано описахме, че продължителното лечение с GbE значително намалява приема на храна и телесното затлъстяване, предотвратява хипергликемия и дислипидемия, докато повишава инсулиновата чувствителност, оценена чрез ITT (инсулинов толерантен тест) при затлъстели плъхове, хранени с обогатена със свинска мас хиперлипидна диета [6]. В съгласие с предишните ни констатации други проучвания предполагат, че приемът на GbE подобрява гликемичния профил както на здрави, така и на пациенти с T2D [14, 15]. В допълнение беше демонстрирано намаляване на повишаването на глюкозата, стимулирано от орално приложение на захаринови агенти при плъхове [16].

Данните по-горе предполагат благоприятни ефекти на GbE върху инсулиновата резистентност и свързаните със затлъстяването разстройства. Изключително важно е обаче да се опишат по-добре механизмите, чрез които GbE подобрява действието на инсулина. В този контекст настоящото проучване има за цел да оцени дали 14-дневното орално лечение с GbE променя ретроперитонеалния депо инсулин WAT и Toll-подобни рецептори, сигнализиращи каскади на индуцирани от диета затлъстели плъхове, модел на инсулинова резистентност.

2. Материали и методи

2.1. Животни

Комитетът по етика на изследванията на животните към Университета на Федерална де Сао Пауло одобри всички процедури за грижи за животните, използвани в това проучване (Номер на процеса: 271359). Всички усилия бяха положени да сведат до минимум страданието. Мъжки плъхове Wistar от CEDEME (Сао Пауло, Бразилия) са настанени по 4 на клетка и са поддържани в контролирани условия на светлина (12: 12 часа светлина/тъмнина, светлини включени в 6 сутринта) и температура (23 ° C ± 1 ° C), със свободен достъп до храна и вода.

Двумесечните плъхове бяха хранени със силно обогатена с мазнини диета, която беше приготвена чрез добавяне на 40% (w/w) стандартна чау плюс 28% (w/w) свинска мас, 2% (w/w) соево масло, 10% (w/w) захароза, 20% (w/w) казеин, за да се получи съдържанието на протеин в контролната диета, и бутилиран хидрокситолуен в количество 0,02% (w/w) от допълнителното масло. Това осигурява 19,5% от енергията като въглехидрати, 23,2% като протеини и 57,3% като мазнини. Таблица 1 показва състава на макронутриентите и мастните киселини от диетата.

маса 1

Макронутриенти и мастни киселинни състави при диета с високо съдържание на мазнини.

Диета с високо съдържание на мазнини
Влажност (%)1.1
Липиди (%)31.6
Протеин (%)27,0
Въглехидрати (%)27.5
Общо хранителни фибри (%)8.6
Минерални остатъци фиксирани (%)4.2
Натриев хлорид (%)0.2
Изчислена енергия (Kcal/g)5.0

След 8 седмици животните бяха разделени на две групи, съгласно фитотерапията, описана по-долу.

2.2. Фитотерапия Лечение

Екстрактът от гинко билоба (GbE) е получен от Южен Анхуей Дапенг (Китай) и съдържа 26,12% флавонови гликозиди, 6,86% терпеноиди, 2,20% гинколид А, 1,11% гинколид В, 1,05% гинколид С и 2,50% от билобалид.

Фитотерапията се провежда за 14-дневен период. Затлъстелите животни бяха разделени на две групи: O + V (затлъстяване + превозно средство) и O + Gb (затлъстяване + гинко билоба). Групата O + Gb се измерва ежедневно с 500 mg/kg GbE [17, 18], разреден в 1 ml 0,9% физиологичен разтвор (носител), докато O + V се измерва с 1 ml носител.

2.3. Увеличаване на телесното тегло, натрупана храна и прием на енергия

По време на периода на лечение с фитотерапия ежедневно се измерва 24-часов прием на храна и телесно тегло. Оценката на приема на храна се изчислява чрез разликата между количеството предлагано хранене и остатъка след 24 часа.

Увеличаването на телесното тегло се изчислява чрез разликата между крайното тегло (последния ден от лечението) и първоначалното тегло (първия ден от лечението). Натрупаният прием на храна и енергия се измерва средно за първите 13 дни от лечението. В последния ден от лечението плъховете бяха държани една нощ на гладно.

2.4. Параметри на ретроперитонеалната мастна тъкан и серум

Плъховете се упояват с натриев тиопентал (80 mg/Kg телесно тегло, интраперитонеално) и се обезглавяват след 10-часов период на гладуване. Ретроперитонеалното депо с бяла мастна тъкан се отстранява и хомогенизира в 1,0 ml лизисен буфер (100 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA и 0,1 mg/ml апротинин; 2 mM PMSF; 10 mM натриев ортованадат; 100 mM натриев флуорид; 10 mM натриев пирофосфат; и 10% TritonX-100). Нивата на провъзпалителния цитокин TNF-α и противовъзпалителния цитокин IL-10 са измерени чрез ELISA комплект (R&D системи).

Кръв от портална вена също се събира за измерване на адипонектин чрез Milliplex MAP (Millipore).

2.5. Западно петно

Плъховете бяха дълбоко анестезирани с натриев тиопентал (80 mg/Kg телесно тегло, интраперитонеално). Коремната кухина беше отворена и бяха взети отрицателни контролни проби (O + V- и O + Gb−) от лявото ретроперитонеално мастно депо. След събирането пробите незабавно се вкарват във флакон, съдържащ 3,0 ml лизисен буфер (100 mM Tris, рН 7,5, 10 mM EDTA и 0,1 mg/ml апротинин; 2 mM PMSF; 10 mM натриев ортованадат; 100 mM натриев флуорид; 10 mM натриев пирофосфат; и 10% TritonX-100), хомогенизира се и се центрофугира при 16000 g в продължение на 40 минути при 4 ° С. След това порталната вена се излага и се инжектират интравенозно 10-5 М инсулин (i.v.). Дясното ретроперитонеално депо за мазнини беше отстранено 90 секунди след i.v. инжектиране на инсулин (положителни проби: O + V + и O + Gb +) по същия протокол, описан по-горе [19, 20]. Общият протеин е количествено определен чрез BCA комплект (BioRad) и пробите са използвани както за имунопреципитация, така и за оценка на общия екстракт.

За да намалим риска от неспецифично свързване на антитела, ние оценихме нивата на IR фосфорилиране след имунопреципитация с антитяло срещу IR. За да се извършат експерименти с имунопреципитация, пробите се инкубират за една нощ с 10 uL първично антитяло анти-IR (инсулин Rβ sc-711) и протеините се утаяват с протеин А сефароза (GE). В крайна сметка протеините се разделят на 10% SDS-PAGE. След това протеините бяха прехвърлени в нитроцелулозни мембрани чрез апарат за мокър пренос (Bio-Rad). Мембраните бяха предварително инкубирани за 1 час в блокиращ буфер (5% говежди серумен албумин [BSA], 1 М Tris, рН 7,5, 5 М NaCl и 0,02% Tween-20). Мембраните се инкубират през нощта при 4 ° С с първичното антитяло срещу p-Tyr (Cell Signaling 8954). След това всички мембрани бяха инкубирани със специфично конюгирано анти-заешко IgG антитяло с пероксидаза от хрян (Cell Signaling 7074), последвано от детекция на хемилуминесценция (Amersham Biosciences). Тъй като всички проби бяха имунопреципитирани с IR антитяло, ние считахме, че ленти с молекулно тегло 95 kDa са свързани с фосфорилираната форма на IR. В допълнение, IR нивата бяха използвани като вътрешни стандарти, тъй като всички останали протеини бяха отстранени по метода на имунопреципитацията.

За да се извършат експериментите с общ екстракт, след количественото определяне на протеина, общите протеини след това се разделят на 8% SDS-PAGE. Протеините се прехвърлят чрез полусух трансферен апарат (Bio-Rad).

Всички мембрани бяха инкубирани за една нощ при 4 ° С с първичното антитяло срещу фосфо-Akt (Cell Signaling Ser 473–9271); Akt (клетъчна сигнализация 9272), фосфо-NF-кВ р65 (клетъчна сигнализация Ser 536–3033), NF-кВ р65 (клетъчна сигнализация 6956), MyD88 (клетъчна сигнализация 4283), TLR4 (SC 293072) и β-тубулин ( 2146). След това всички мембрани бяха инкубирани със специфично конюгирано анти-мишко/заешко IgG антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (Cell Signaling 7076; Cell Signaling 7074, респ.), Последвано от откриване на хемилуминесценция (Amersham Biosciences). Като вътрешен стандарт се използва нивото на β-тубулин (Cell Signaling 2146).

Количественият анализ беше извършен със софтуер Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). Във всички експерименти поне една проба от всяка група беше анализирана едновременно и резултатите бяха изразени като процентна промяна спрямо базовите нива.

2.6. Екстракция на РНК и количествена верижна реакция на полимераза в реално време (qPCR)

За да се оцени генната експресия на Adipo R1, Adipo R2 и IL-10, бяха проведени допълнителни групи (O + V и O + Gb) от по пет плъха. За пълна екстракция на РНК, двеста mg замразена ретроперитонеална мастна тъкан от всяка проба се хомогенизират чрез добавяне на 1 ml реактив Trizol (Invitrogen, САЩ). Пробите се центрофугират при 16.000 g в продължение на 15 минути при 4 ° С и водната фаза се отстранява и се смесва с 0.5 mL изопропилов алкохол. След центрофугиране при 16.000 g в продължение на 10 минути при 4 ° С, утайката се измива с 1 mL 75% етанол и след това се разтваря в 20 µL обработена с DEPC вода (Ambion, САЩ).

Един микрограм РНК се транскрибира обратно в cDNA, като се използва cDNA комплект с голям капацитет (Applied Biosystems). Експресията на гена беше оценена чрез qPCR в реално време, използвайки Taqman PCR тестове. Праймерите и каталожните номера на сондата бяха Adipo R1 (Rn01483784_m1), Adipo R2 (Rn01463173_m1), IL-10 (Rn00563409_m1) и Actin b (Rn00667869_m1).

Реакциите бяха проведени в 96-ямкови плаки и проведени в три екземпляра. Условията за амплификация се състоят от 40 цикъла от 50 ° C/2 минути, 95 ° C/10 минути, 95 ° C/15 s и 60 ° C/1 min. Методът 2 ΔΔCt се използва за оценка на относителното количествено определяне на амплификационните продукти.

2.7. Статистика

Статистическият анализ беше извършен с използване на PASW Statistics версия 19 (SPSS Inc, Чикаго, IL, САЩ) с нивото на статистическа значимост, зададено на P Фигура 1 (а). Интересно е да се отбележи, че групата O + Gb е приела 6,3% по-малко от групата O + V (P = 0,031). Във връзка с енергийния прием може да се види на Фигура 1 (b), че O + Gb също е показал значително намаление от 6,3% в сравнение с O + V (P = 0,031).