1 Катедра за усъвършенствана медицина за стареене, Медицински факултет на Университета Чиба, Чиба 260-8670, Япония

богато

Резюме

1. Въведение

Вътрешното стареене на кожата, предизвикано от хронологични или присъщи фактори, води до атрофия на кожата [1]. Компонентите на кожния колаген показват възрастово намаление както при мъжете, така и при жените, което води до изтъняване на кожата при възрастни индивиди [2]. Натрупаните данни сочат, че оксидативно модифицираните протеини, ДНК и липиди в кожата и други органи по време на стареенето се натрупват постепенно [3], което показва, че реактивните кислородни видове (ROS) са силно свързани със стареенето на кожата. За да се смекчат окислителните щети, в клетките се упражняват множество антиоксидантни и възстановителни системи. Супероксиддисмутазата (SOD) играе централна роля в антиоксидантните системи поради способността си да катализира клетъчните супероксидни радикали (

) до H2O2. H2O2 се разгражда допълнително до O2 и H2O чрез каталаза, глутатион пероксидази и пероксиредоксини. Медно-цинковата супероксидна дисмутаза (SOD1) е локализирана да реагира вътреклетъчно в цитоплазмата. Предишните ни проучвания демонстрираха това Sod1-дефицитен (Sod1 -/-) мишки показаха засилване на вътреклетъчните и различни фенотипове, подобни на стареенето на органи, което предполага, че цитоплазмените медиирани окислителни увреждания причиняват главно промени, подобни на стареенето в различни тъкани [4]. Особено, Sod1 недостатъчността води до епидермални и дермални атрофии, свързани с понижаване на регулацията на гените, свързани с извънклетъчната матрица, включително Col1a1 и с повишено регулиране на свързаните с възрастта гени, включително p53 [5, 6]. Следователно, Sod1 -/- мишката е подходящ модел за изследване на стареенето на кожата при възрастни хора.

Melinjo (индонезийско име; Gnetum gnemon Linn) е дървесно двудомно растение, което се отглежда широко в Югоизточна Азия. Плодовете и семената му се използват като обикновен зеленчук в Индонезия. Семената Melinjo съдържат различни стилбеноиди, включително транс-ресвератрол (3,5,4′-трихидрокси-транс-стилбен), неговия глюкозид, ресвератролов димер (гнетин С) и ресвератролов димерен глюкозид (гнетин L, гнемонозид А, гнемонозид С и гнемонозид Г) [7]. Екстрактът от семена Melinjo (MSE) разкрива DPPH отстраняване на радикали [7], липаза и

2. Материали и методи

2.1. Реактиви

MSE (Номер на партида YMP-M-110115) е предоставен от Института за пчелни продукти и здравни науки, Yamada Bee Company, Inc. (Окаяма, Япония). MSE съдържа транс-ресвератрол (RSV, 0,10% w/w), гнетин C (2,03% w/w), gnemonoside A (16,35% w/w) и gnemonoside D (3,97% w/w). Ресвератрол (RSV) е получен от Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (CAS 501-36-0, Токио, Япония). Чистотата на RSV е повече от 98%.

2.2. Мишки и диети

Sod1 -/- мишки са закупени от лабораторията Jackson (Bar Hrbor, ME, САЩ). Генотипирането на Sod1 -/- алелът беше извършен с използване на геномна PCR с геномна ДНК, изолирана от върха на опашката, както беше съобщено по-рано [20]. Животните бяха настанени при стайна температура от

° С, относителна влажност от

%, и 12 h цикъл светлина/тъмнина и бяха хранени ad libitum. Експерименталните процедури бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните от университета в Чиба. На 4-седмична възраст мишките бяха разделени на случаен принцип в четири групи и хранени със съответните експериментални диети в продължение на 12 седмици: контролна MF диета (състав: 7,9% вода, 21,1% протеин, 5,1% липид, 5,8% пепел, 2,8% фибри и 55,3 % разтворим екстракт без азот, 359 kcal/100 g, Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония), контролна MF диета, съдържаща 0,04% (w/w) RSV, както е описано по-рано [15], и контролна MF диета, съдържаща 0,1 % или 0,5% (т/т) MSE (Номер на партида YMP-M-110115) съгласно предишното проучване [8].

2.3. Хистология

За хистологична морфология кожни проби от задни тъкани се дисектират и фиксират в 20% формалин неутрален буферен разтвор (Wako, Osaka, Japan) за една нощ. След дехидратация и проникване, кожните проби се вграждат в парафин и се разделят на микротом (ROM-380, Yamato Koki Kogyo Co. Ltd., Saitama, Япония) в 4 μm дебелина по стандартни техники. Оцветяването с хематоксилин и еозин за морфология на кожата и оцветяването в червено по Sirius за цялостно отлагане на колаген бяха извършени, както е описано по-рано [21-23]. Дебелината на кожната тъкан е измерена с помощта на софтуера за изображения Leica QWin V3 (Leica, Германия).

2.4. Измерване на маркери на оксидативен стрес

За да се измери съдържанието на 8-изопростан, кръвта се събира от пространството на лявата камера и се центрофугира при 12 000 об/мин в продължение на 5 минути при стайна температура. Плазмата се отделя от съсирената кръв и се добавя 100 μМ индометацин и 0,005% дибутилхидрокситолуен. Нивото на 8-изопростан е измерено с помощта на комплект 8-изопростан EIA (Cayman Chemical Company) в съответствие с инструкциите на производителя. Плазмата също беше изследвана за концентрацията на протеин с помощта на DC протеинов комплект за анализ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и нивата на 8-изопростан бяха нормализирани до нивото на протеина.

За вътреклетъчно измерване на ROS, клетките на костния мозък (5-10 × 105 клетки/две пищяла на мишка) се събират чрез промиване на пищялите с буфериран с фосфат физиологичен разтвор с помощта на 26-G игли и се оцветяват с 10 μМ от CM-H2DCFDA (DCF, Life Technologies Corporation) за 30 минути при 37 ° C. Първичните дермални фибробласти се инкубират с 10 μМ DCF за 30 минути при 37 ° С. След инкубация клетките бяха трипсинизирани и ресуспендирани в PBS. Интензитетът им на флуоресценция се оценява с помощта на проточен цитометър (BD FACSCanto II, BD Biosciences).

2.5. Клетъчна култура

Кожните тъкани бяха разрязани Sod1 -/- новородени на 5-дневна възраст. Първичните дермални фибробласти се изолират чрез дисоциация в 0,2% колагеназа тип 2 (Worthington Biochemical Corporation Lakewood, NJ, USA) при 37 ° С за 60 минути. Клетките се култивират в -MEM (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), допълнена с 20% фетален говежди серум (FBS), 100 единици/ml пеницилин и 0,1 mg/ml стрептомицин при 37 ° C в овлажнен инкубатор с 5 % CO2 и 1% O2. Клетките се третират с 10 μM RSV на 72 часа. Ние определихме концентрацията и продължителността на лечението с RSV в това проучване съгласно предишния ни доклад [6].

2.6. Анализ на израстването

Кожата на гърба се стерилизира със 70% етанол, изплаква се с PBS (Takara Bio Inc., Shiga, Япония) и се щанцова на дискове с диаметър 5 mm с дермален удар (Nipro, Токио, Япония). Перфорираните кожни дискове се поставят в 12-ямкова културална плоча (Falcon BD, Franklin Lakes, NJ) и се култивират със или без 10 μM RSV в -MEM, съдържащ 20% FBS, 100 единици/ml пеницилин и 0,1 mg/ml стрептомицин при 37 ° C в овлажнен инкубатор с 5% CO2 и 1% O2. Броят на израстващите фибробласти, произхождащи от диска на кожата на мишката, се отчита директно на 72 часа след култивирането. Методът на този експеримент е извършен, както е описано по-рано [5].

2.7. Количествена PCR

Общата РНК беше извлечена от кожата на гърба с помощта на реактива Trizol (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), съгласно инструкциите на производителя. кДНК се синтезира от 1 μg обща РНК, използвайки обратна транскриптаза (ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, Toyobo, Osaka, Japan). PCR в реално време се извършва на MiniOpticon (Bio-Rad) със SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) в съответствие с инструкциите на производителя. Всички данни бяха нормализирани до нивото на домакинския ген глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (Gapdh). За анализа бяха използвани следните праймери: Gapdh, напред, 5′-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ и назад, 5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3 ′; Col1a1, напред, 5′-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3 ′ и назад, 5′-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3 ′; стр53, напред, 5′-ACGCTTCTCCGAAGACTGG-3 ′ и назад, 5′-AGGGAGCTCGAGGCTGATA-3 ′; Sirt1, напред, 5′-CAGTGAGAAAATGCTGGCCTA-3 ′ и назад, 5′-TTGGTGGTACAAACAGGTATTGA-3 ′.

2.8. Статика

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Student’s т-тест за сравнение между две групи и тест на Tukey за сравнение между три групи. Разликите между данните се считат за значителни, когато

стойностите са по-малки от 0,05. Всички данни са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD).

3. Резултати

3.1. MSE и RSV отслабват атрофията на кожата на Sod1 -/- Мишки

SOD1, един от клетъчните антиоксидантни ензими, играе ключова роля в регулирането на окислителния и редукционен баланс. Sod1 -/- мишките показаха свързана с възрастта атрофична морфология в кожата си, придружена от дегенерация на колаген [5]. Затова използвахме Sod1 -/- мишки за изследване на стареенето на кожата и за скрининг на антиатрофни съединения в дебелината на кожата [24–26]. В този контекст изследвахме антиатрофични ефекти на MSE и RSV върху дебелината на кожата на Sod1 -/- мишки.

10–12). Статистическите оценки бяха извършени с помощта на теста на Tukey’s. Тези данни показват средната стойност ± SD;

. Мащабната лента представлява 100 μм.

8–12). Статистическите оценки бяха извършени с помощта на двустранния Student’s т-тест за несдвоени стойности. Тези данни показват средната стойност ± SD;

. Мащабната лента представлява 100 μм.

3.2. MSE и RSV променят генната експресия в Sod1 -/- Кожа

Да се ​​изследва механизмът за предотвратяване на атрофия на кожата на MSE и RSV върху атрофия на кожата в Sod1 -/-, анализирахме модели на експресия на тип I колаген и свързани с възрастта гени в кожата. В Sod1 -/- кожа, ниво на иРНК на Col1a1 беше значително по-ниско регулиран в сравнение с тези на Sod1 +/ +, което показва намалена биосинтеза на колаген (Фигура 2 (b)). Освен това р53, един от основните гени, свързани с възрастта, също значително се регулира в Sod1 -/- кожа (Фигура 2 (в)). Лечението с MSE и RSV значително нормализира нивата на иРНК на Col1a1 и стр53 в Sod1 -/- кожа (Фигури 2 (б) и 2 (в)). Интересното е, че разкрихме, че лечението с MSE и RSV също значително се регулира Sirt1 израз, предполагащ молекулната връзка между Sirt1 изразяване и изтъняване на кожата в Sod1 -/- мишки (Фигура 2 (d)). Тези открития демонстрират, че прилагането на MSE и RSV диети подобрява атрофията на кожата, придружена от нормализиране и активиране на свързаните с възрастта гени в Sod1 -/- мишки.

3.3. MSE и RSV значително намаляват окислителните щети през Sod1 -/- Мишки

Sod1 -/- мишките показаха значително увеличение на няколко маркера за окислително увреждане, включително липидна пероксидация, в тъканите [20, 24, 27, 28]. За да се оцени окислителното увреждане, ние измерихме нивата на липидно пероксидация в плазмата. По отношение на нивата на 8-изопростан, диетите, съдържащи MSE и RSV, значително намаляват съдържанието на 8-изопростан в плазмата (Фигура 3 (а)). Освен това диетите, съдържащи MSE и RSV, намаляват вътреклетъчното ниво на ROS в клетките от костния мозък (Фигура 3 (b)). Тези данни показват, че лечението с MSE и RSV смекчава окислителните щети през Sod1 -/- мишки.

10–12). (b) Вътреклетъчните нива на ROS на клетките на костния мозък на Sod1 -/- и Sod1 +/ + мишки бяха измерени с помощта на DCF багрило (

5-6). (c) Относителното вътреклетъчно ниво на ROS в Sod1 -/- фибробласти, третирани с 10 μM RSV за 72 h е измерен с DCF багрило (

). Статистическите оценки бяха извършени с помощта на теста на Tukey’s. Тези данни показват средната стойност ± SD;

3.4. MSE и RSV значително възстановяват жизнеспособността в Sod1 -/- Фибробласти

Проучихме дали лечението с RSV отслабва вътреклетъчното производство на ROS и насърчава разпространението на Sod1 -/- фибробласти инвитро. Предварителните експерименти разкриват, че лечението с RSV в продължение на 24 часа с различни концентрации от 30 до 100 μМ леко потиснат клетъчната жизнеспособност на Sod1 +/ + фибробласти. За разлика от това, 10 μM RSV лечението в продължение на 72 h не показва неблагоприятен ефект от жизнеспособността на клетките през Sod1 +/ + фибробласти. Поради това определихме дозата и продължителността на RSV експеримента инвитро. Анализът на поточния цитометър показва, че лечението с RSV значително намалява вътреклетъчното генериране на ROS през Sod1 -/- фибробласти (Фигура 3 (в)). Нещо повече, експериментите с култура на органи с помощта на кожни дискове разкриха, че Sod1 -/- фибробластите показват значително потискане на способността си за израстване в сравнение с наблюдаваното в Sod1 +/ + мишки (Фигура 4 (а)). Лечение с 10 μM RSV значително усилва активността на фибробластите за израстване от Sod1 -/- кожни дискове (Фигура 4 (б)). Тези констатации колективно предполагат, че RSV насърчава миграцията и разпространението на Sod1 -/- фибробласти инвитро.

). Броят на фибробластите беше преброен на ден 3. Статистическите оценки бяха извършени с помощта на двустранния Student's т-тест за несдвоени стойности. Тези данни показват средната стойност ± SD;

. Мащабната лента представлява 100 μМ.

4. Дискусия

Както е показано на Фигура 2 (в), Sod1 дефицит показа повишено регулиране на стр53 генна експресия, която регулира клетъчното стареене и смърт, в кожата (Фигура 2 (в)). Преди това съобщихме за това Sod1 индуцирана загуба и регулирано ниво на протеин p53 в кожни фибробласти [6]. Производните на аскорбинова киселина значително регулират експресията на p53 и подобряват жизнеспособността на клетките в Sod1 -/- фибробласти [6, 25]. В генетично модифициран модел, p53 активирането индуцира ускорени стареещи подобни фенотипове, включително атрофия на кожата, при p53 мутантни мишки [34]. Gannon et al. също съобщи, че p53 активиране от Mdm2-специфична загуба в кератиноцитите, индуцирана епидермални стареене и атрофия на стволови клетки при мишки, което предполага, че активирането на p53 в кожата ускорява стареенето като изтъняване на кожата при мишки [35]. Лечението с MSE и RSV значително понижава нивото на иРНК на стр53 в Sod1 -/- кожа (Фигура 2 (в)). Тези данни показват, че лечението с MSE и RSV може да забави стареенето на кожата чрез намаляване на повишаването на р53 в кожата.

RSV насърчава активността и изразяването на Sirt1 [15]. MSE и RSV също нормализират генната експресия на Col1a1 и регулира генната експресия на Sirt1 в кожата на Sod1 -/- мишки (Фигури 2 (б) и 2 (г)). Sirt1 повишеното регулиране от RSV може да предпази стареенето на кожата от окислително увреждане през Sod1 -/- мишки. Всъщност, Lee et al. съобщава, че лечението с RSV или Sirt1 свръхекспресията значително инхибира експресията на матричната металопротеаза-9 и изглежда предпазва колагена от разграждане след ултравиолетово облъчване в човешки дермални фибробласти и кожни тъкани [36]. Serravallo et al. съобщи, че Sirt1 играе ключова роля в модулирането на кожни заболявания, включително псориазис, автоимунно заболяване, кожна гъбична инфекция, наследствени дерматологични заболявания и рак [19]. Тези констатации показват, че повишеното регулиране на Sirt1 експресия защитени увреждания на кожата in vivo.

Наскоро Konno et al. съобщава, че RSV и MSE показват агонистична активност за PPAR и PPAR

инвитро [12]. Съобщава се, че PPAR

двоен агонист, MHY966, лечението значително потиска индуцираното от UVB разграждане на колаген, липидната пероксидация и възпалителния отговор чрез активиране на PPAR и PPAR в кожата на мишката по време на фотостареене [37]. Освен това Mastrofrancesco et al. съобщава, че активирането на PPAR в кожата нормализира възпалителния отговор при IL-21-индуцирана епителна хиперплазия при мишки [38]. Тези доклади предполагат, че RSV и MSE могат да активират PPAR и PPAR, което води до затихване на атрофията на кожата в Sod1 -/- мишки.

И накрая, тук, ние се фокусирахме върху RSV при MSE и антиатрофичните ефекти на RSV в Sod1 -/- кожа. Тъй като MSE съдържа също няколко RSV-производни като гнетин С, гнемонозид А и гнемонозид D, не можем да изключим антиатрофични ефекти на RSV производни в MSE. Необходим е допълнителен анализ за изясняване на благоприятния ефект на други производни на RSV при MSE върху атрофията на кожата през Sod1 -/- мишки.

5. Заключение

В настоящото проучване ние демонстрирахме, че лечението с MSE и RSV ефективно отслабва подобни на стареенето кожни патологии, придружени от регулиране на Sirt1 израз в Sod1 -/- кожа. MSE и RSV също проявяват по-малко неблагоприятен ефект върху морфологията на кожата. В съответствие с нашите резултати, много интервенции отчитат безопасността на лечението на MSE и RSV при хора. Следователно MSE е полезен за хранителен източник на RSV, както и антиоксидант за безопасност за забавяне стареенето на кожата при хората.

Конфликт на интереси

Това изследване беше подкрепено от института за пчелни продукти и здравни науки, Yamada Bee Company, Inc.

Благодарности

Авторите благодарят на Tomoki Ikuta, Keiko Kobayashi и Tomoki Tatefuji (Yamada Bee Company) за предоставянето на MSE и полезни дискусии. Те също така благодарят на д-р Keiji Kobayashi, д-р Masato Koike и Toshihiko Toda, от университета Chiba, за тяхната ценна техническа помощ.

Препратки