Резюме

Епигалокатехин галатът (EGCG) е полифенол, който е в изобилие в зеления чай. Съобщава се, че консумацията на EGCG може да допринесе за загуба на тегло, но основният механизъм не е напълно разбран. За да се определи как EGCG намалява телесните мазнини, е използван модел на организма Caenorhabditis elegans, който е полезна система от животински модели при изследване на важни биологични механизми, които са лесно приложими за хората. В това проучване се отглеждат различни щамове в продължение на два дни на диета Escherichia coli OP 50 със или без лечение с 100 μM и 200 μM EGCG. Настоящите резултати показват, че 100 μM и 200 μM EGCG значително намаляват съдържанието на триглицериди в червеи от див тип с 10% и 20% (P-стойност Ключови думи: Caenorhabditis elegans, EGCG, натрупване на мазнини, липиден метаболизъм

натрупването

ВЪВЕДЕНИЕ

Зеленият чай е популярна напитка с високо съдържание на флавоноиди (естествен полифенол) и е известно, че има много желани ползи за здравето, като антиканцерогенни, противовъзпалителни и антиоксидативни ефекти (1). Епигалокатехин-3-галатът (EGCG) е най-разпространеният катехин в зеления чай, за който се смята, че е отговорен за тази биоактивност в зеления чай (2). Съобщава се, че EGCG има ефект на намаляване на мазнините чрез инхибиране на енергийния прием при индуцирани от диета затлъстели мишки (3,4), инхибиране на липогенезата in vitro (5,6), инхибиране на активността на α-амилазата in vitro (7), инхибиране на храносмилането и абсорбция при мишки с високо съдържание на мазнини (8), стимулиране на енергийните разходи in vivo (9), насърчаване на окисляването на мазнини както in vivo (10), така и in vitro (11) и насърчаване на липолиза (12,13).

Caenorhabditis elegans е широко използван в биологични и медицински изследвания поради кратката им продължителност на живота

20 дни, репродуктивен цикъл от 3 дни и голям размер на пило от около 300 яйца чрез самооплождане (14). Освен това той съхранява 65% от гените, свързани с човешките заболявания (15), включително тези, свързани с липидния метаболизъм, което го прави чудесен in vivo модел за клетъчни и генетични изследвания. При C. elegans по-рано е показано, че EGCG показва антиоксидантни активности (16), намалява свързаните със стреса реакции (17) и удължава дълголетието (18). Няма обаче доклад за EGCG за ефекта на намаляване на мазнините при C. elegans. Следователно, това проучване трябваше да изследва дали EGCG може да играе роля за намаляване на съдържанието на мазнини в C. elegans.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали

Използваните в това проучване щамове C. elegans и Escherichia coli OP50 са получени от Центъра по генетика на Caenorhabditis (CGC, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA), включително N2, bristal (див тип); CE541, sbp-1 (ep79) III; RB754, aak-2 (ok524) X; RB1716, nhr-49 (ok2165) I; BX107, мазнина-5 (tm420) V; BX106, мазнина-6 (tm331) IV; BX153, мазнина-7 (wa36) V; RB1600, вана-1 (ok1972) II; GR1307, daf-16 (mgdf50); OP50 и OP50-зелен флуоресцентен протеин (GFP) E. coli. EGCG (чистота> 99%) и реактивът за триглицериди Infinity ™ са закупени от Fisher Scientific (Питсбърг, Пенсилвания, САЩ). Реагентът за анализ на протеина Coomassie Plus е получен от Thermo Fisher Scientific (Middletown, VA, USA). 5-флуоро-2’-деоксиуридин (FUdR) е закупен от Sigma-Aldrich Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Домакински белина (The Clorox Company, Оукланд, Калифорния, САЩ) се използва за избелване на червеите при синхронизиране на червеи L1.

Приготвяне на разтвор на EGCG и култура от червеи

EGCG се разтваря в стерилизирана вода и се филтрира през мембрана с диаметър 0,22 μm преди употреба. По-рано беше съобщено, че 200

400 μM EGCG е оптималната концентрация за увеличаване на продължителността на живота при C. elegans (19), така че ние избрахме 100 μM и 200 μM EGCG като лечебни групи за изследване на ефектите за намаляване на мазнините при C. elegans.

В културите на C. elegans (20) са използвани агар M9 буфер, S-пълен и среда за растеж на нематоди (NGM). След синхронизиране, всички L1 червеи бяха отгледани при 25 ° C в S-пълна среда, допълнена с E. coli OP50 и третирани със или без EGCG в продължение на 2 дни.

Количествено определяне на триглицеридите

След 2 дни лечение с EGCG, C. elegans се събира и промива два пъти с вода за отстраняване на Е. coli и EGCG. Пробите от C. elegans се разтварят в 0,05% разтвор на Tween 20. След обработка с ултразвук пробите се използват за измерване на триглицеридите (TG) и протеините. TG анализът се провежда с Infinity ™ триглицериден реагент и съдържанието на протеин се измерва с Coomassie Plus Protein Assay Reagent (21). След това съдържанието на TG се нормализира с протеинови концентрации.

Измерване на скоростта на растеж, размера на тялото, движението и приема на храна

След двудневното третиране нематодите се прехвърлят в нови плочи от агар, за да се измери скоростта на растеж. За всяка лечебна група,

50 червея бяха избрани на случаен принцип и парализирани, използвайки 10 mM NaN3 (22,23). Броят на червеите на различни етапи се преброява под оптичен микроскоп (Olympus Corporation, Токио, Япония).

След двудневното лечение нематодите бяха прехвърлени в нови плочи с прясна Е. coli OP50 за измерване на размера на тялото и движението (22). 30-секундно видео е записано и използвано за дължината, ширината и скоростта на движение на червеите, използвайки системата за проследяване на Wormlab (софтуер WormLab версия 3.1.0, MicroBrightField Inc., Williston, VT, USA).

За проследяване на приема на храна от нематоди, синхронизирани с възрастта N2 нематоди се култивират върху бактериални тревни площи на E. coli OP50-GFP върху NGM плочи със или без EGCG (24). След третиране в продължение на 2 дни нематодите се измиват два пъти с вода, поставят се и се фиксират върху предметни стъкла, които се приготвят с пресни 5% агарови подложки и след това се визуализират под флуоресцентен микроскоп. Интегрираната плътност е определена количествено с помощта на софтуера Image J (Национален институт по здравеопазване на САЩ, Bethesda, MD, САЩ) чрез определяне на средната интензивност на пикселите. Скоростта на изпомпване също се измерва чрез преброяване на скоростта на фарингеални мускулни контракции от C. elegans под оптичния микроскоп (25).

анализ на експресията на иРНК

Общата РНК беше извлечена от C. elegans, като се използва реагентът TRIzol ® при условия без RNase (22,23). Общата РНК се транскрибира обратно в cDNA, като се използва комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA). Полимеразна верижна реакция в реално време (PCR) се извършва върху PCR система StepOne Plus в реално време (Applied Biosystems). Използвахме cebp-2 (Ce02421574_g1), hosl-1 (Ce02494529_m1), atgl-1 (Ce02406733_g1), mdt-15 (Ce02406575_g1), pod-2 (Ce 02427721_g1) и acs-2 (Ce1248619ays_g) . Праговите стойности бяха анализирани с помощта на сравнителния CT метод. Като вътрешен стандарт беше използван гена на РНК полимераза II голяма субединица ama-1 (Ce02462726_m1).

Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности ± стандартни грешки (SE). Статистическият анализ за всички данни е извършен от Системата за статистически анализ (SAS версия 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA). Данните на фиг. 2В, 3А, 3А, 4, 4 и и 5 5 са ​​анализирани чрез еднопосочен ANOVA. Данни на фиг. 1, 2A, 2A и 3B

D се анализират чрез двупосочен ANOVA (лечение и експеримент). Във всички данни не е установено взаимодействие между лечението и експеримента. За определяне на ефектите от лечението е използван тест за множество сравнения на Tukey. Разликите са дефинирани на P Фиг. 1). Скоростта на изпомпване е механично движение, което представлява прием на храна при C. elegans (25). Лечението на EGCG в продължение на 2 дни няма ефект върху скоростта на изпомпване на нематоди от див тип (фиг. 2А). Проведохме друг експеримент, използвайки E. coli OP50-GFP за измерване на приема на храна. Анализът на флуоресцентния интензитет (фиг. 2В) показва, че няма значителна разлика между обработваната и контролната групи, което съответства на скоростта на изпомпване. Представителните изображения на C. elegans, хранени с E. coli OP50-GFP, са показани на фиг. 2С. Тези резултати предполагат, че EGCG не повлиява приема на храна при C. elegans.

EGCG няма ефект върху растежа и развитието

Леченията с EGCG, както при 100 μM, така и при 200 μM, не показват значителен ефект върху скоростта на растеж (фиг. 3А), дължината на тялото (фиг. 3В) и локомотивните дейности (фиг. 3D). Докато при 200 μM, телесната ширина на червеите намалява в сравнение с контрола (фиг. 3С), което може да се дължи на намалените телесни мазнини, наблюдавани на фиг. 1. Взети колективно, тези данни показват, че EGCG няма ефект върху растежа, дължината на тялото или локомотивните дейности, но има значителен ефект върху телесната ширина при по-висока концентрация в C. elegans.

EGCG потенцирана липолиза

След това са известни различни мутантни щамове, свързани с липидния метаболизъм, включително sbp-1 (кодиращ ортолог на свързващ протеин елемент на стерол отговор), nhr-49 (кодиращ рецептор на ядрен хормон и функционален ортолог на активираните от пероксизома пролифератор рецептори ), aak-2 (кодиращ един от двата хомолога на AMP-активираните протеинкинази), tub-1 (кодиращ хомолог на TUBBY), мазнини-5, 6 и 7 (ендодиращи делта 9 десатуразни хомолози) и daf- 16 (кодиране на хомолог на транскрипционния фактор на кутията Forkhead). Наблюдавани са значителни разлики между нивото на TG в контролните и EGCG третирани групи в тези щамове, което предполага, че ефектите от намаляването на мазнините от EGCG са независими от sbp-1, nhr-49, aak-2, tub-1, fat-5, мазнини-6, мазнини-7 и daf-16 в C. elegans (фиг. 4).

Освен това определихме експресии на гени, участващи в липидния метаболизъм при див тип C. elegans, включително cebp-2 (кодиращ хомолог на CCAAT/свързващ протеин енхансер), acs-2 (кодиращ хомолог на ацил-CoA синтетаза), mdt-15 (хомолог на медиаторен комплекс субединица 15), pod-2 (кодиращ хомолог на ацетил-CoA карбоксилаза α), hosl-1 (кодиращ хомолог на хормоночувствителна липаза) и atgl-1 (кодиращ хомолог на мастната триглицеридна липаза). EGCG значително намалява експресията на atgl-1 и acs-2 при 100 μM и 200 μM в сравнение с контролата, докато други гени не показват разлика (Фиг. 5). Тези данни показват, че ефектът на намаляване на мазнините от EGCG при C. elegans може да зависи от acs-2 и atgl-1.

ДИСКУСИЯ

В настоящото проучване EGCG (100 μM и 200 μM) значително намалява натрупването на мазнини по дозозависим начин при диви червеи, без да променя приема на храна, скоростта на растеж, размера на червея или локомотивната активност. Това е в съответствие с предишни доклади, че лечението с EGCG може да намали натрупването на мазнини при плъхове с високо съдържание на мазнини (26) и че 100 μM EGCG намалява натрупването на липиди на 3T3-L1 преадипоцити (6). Настоящите резултати по-нататък показват, че EGCG не влияе върху енергийния прием или физическата активност (като част от енергийните разходи), което предполага метаболитното му участие върху намаляването на мазнините.

По-рано беше съобщено, че катехините на зеления чай могат да намалят липогенезата чрез инхибиране на активността и/или експресията на липогенни ензими, като синтаза на мастни киселини (FAS), свързващ протеин регулаторен елемент на стерол-1с и стеароил-КоА десатураза-1 при гризачи животни (27). Освен това се съобщава, че EGCG намалява съхранението на мазнини чрез активиране на AMP-активирана протеин киназа in vitro (28). Настоящите резултати обаче показват, че EGCG може да не упражнява ефекта си на намаляване на мазнините чрез мазнини-5, мазнини-6, мазнини-7, sbp-1, nhr-49, daf-16 или aak-2 при C. elegans. Тъй като не сме определили ролята на EGCG във FAS, възможно е EGCG да действа чрез FAS заедно с допълнителни липогенни ензими, като елонгаза на мастни киселини и 3-кетоацил-КоА редуктаза (LET-767) (29). Алтернативно, други катехини в зеления чай, включително епикатехин, епигалокатехин и епикатехин-3-галат (30), могат да допринесат за намаляване на съдържанието на мазнини, а не EGCG.

Tho и Wolfram (4) съобщават, че диетичният EGCG насърчава окисляването на мазнините при мишки. Освен това, едно проучване при мъже с наднормено тегло/затлъстяване показва, че само EGCG има потенциал да стимулира окисляването на мазнините и по този начин може да окаже ефект против затлъстяване (10). В C. elegans acs-2 кодира ацил-КоА синтетаза, която катализира превръщането на мастна киселина в ацил-КоА за последващо окисление (31). Настоящият резултат обаче предполага, че EGCG намалява експресията на acs-2 в нематоди от див тип, което показва, че EGCG може да инхибира окисляването на мазнините, въпреки че общото натрупване на мазнини все още е намалено при C. elegans. По-рано се съобщава за подобни несъответствия, че фенотипите с ниско съдържание на мазнини могат да доведат до компенсаторно потискане на транскрипцията на acs-2, за да се предотвратят допълнителни енергийни разходи (32). По този начин заключихме, че намалената експресия на acs-2 от EGCG няма значение върху ефекта му върху общите телесни мазнини в този модел. Като алтернатива е възможно другите механизми, като например пост-транслационно регулиране на acs-2 (33), да са отговорни за ефекта на EGCG за намаляване на мазнините. Този и други механизми може да се нуждаят от допълнително проучване.

Има все повече доказателства, че EGCG може да засили липолитичните активности в 3T3-L1 адипоцитите (13). Въпреки това, Söhle et al. (12) съобщават, че EGCG не е допринесъл за стимулиращия ефект на екстракта от бял чай върху липолизата в човешки подкожни адипоцити. Следователно противоречивите твърдения предполагат, че EGCG има противоречиви ефекти върху липолизата. ATGL е мастна триглицеридна липаза, която е отговорна за липолизата (34). Текущите резултати показват, че EGCG намалява експресията на atgl-1 при нематоди от див тип, което предполага, че EGCG инхибира липолизата в C. elegans. Въпреки това, освен че се използва като маркер за липолиза, ATGL е известно, че се използва и като маркер за адипогенеза, тъй като остава силно експресиран в зрели адипоцити (35). По този начин, намалената експресия на atgl-1 чрез EGCG може да предполага инхибиране на адипогенезата, а не намалена липолиза. Това е в съответствие с in vitro проучванията, проведени от Hwang et al. (6) и Moon et al. (28). Като цяло настоящите резултати не биха били достатъчни за определяне на потенциалните механизми на ефектите на EGCG за намаляване на мазнините, поради което са необходими допълнителни изследвания за изследване на влиянието на acs-2 и atgl-1 на пост-транслационно ниво.

В обобщение, настоящите резултати заключават, че ефектът на EGCG върху намаляването на мазнините в C. elegans зависи от atgl-1 и acs-2. EGCG може да инхибира адипогенезата, за да намали съдържанието на мазнини в C. elegans, както е показано от намаленото ниво на експресия на гена atgl-1 след лечение с EGCG. По този начин, консумирането на EGCG като хранителна добавка може потенциално да контролира съдържанието на мазнини в тялото.