Биопроцесорно инженерство

Тази статия е част от изследователската тема

Биопроцеси, техники за пречистване и системи за доставка на биоактивни вещества в храни и хранителни вещества, Част II Вижте всички статии

Редактиран от
Арнолдо Лопес-Ернандес

Университет на Уисконсин-Медисън, САЩ

Прегледан от
НОППОЛ -. ЛЕКСАВАСДИ

Университет Чианг Май, Тайланд

Моника Алварес

Испански национален център за изследване на рака (CNIO), Испания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

frontiers

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Молекулярна онкология и хранителна геномика на рака, IMDEA-Food Institute, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания
  • 2 Производство и характеризиране на отдела за нови храни, Институт по научни изследвания в областта на храните CIAL, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания
  • 3 Производство и разработване на храни за здраве, IMDEA-Институт по храните, CEI UAM + CSIC, Мадрид, Испания

Въведение

През последните години има голяма загриженост за увеличаването на хроничните заболявания, свързани с метаболизма, включително метаболитен синдром, сърдечно-съдови заболявания, инсулинова резистентност, затлъстяване и рак. Важно е, че се изчислява, че до една трета от смъртните случаи от рак могат да бъдат предотвратени чрез модифициране на ключови рискови фактори, като диета и упражнения, поради тяхната връзка със затлъстяването (Parkin et al., 2011; Brown et al., 2018) . Многобройни епидемиологични проучвания показват, че затлъстяването увеличава риска от развитие на различни видове рак (Lauby-Secretan et al., 2016), а натрупването на доказателства показва, че общото метаболитно състояние на индивида може да допринесе за молекулните промени по време на канцерогенния процес. Ключово събитие по време на туморогенезата е препрограмирането на енергийния метаболизъм на рака (Hanahan и Weinberg, 2011), а свързаните със затлъстяването промени (хормони, растежни фактори, цитокини и други възпалителни молекули) могат да насърчават протуморални сигнали в пред- или неопластични клетки чрез взаимодействащи чрез техните рецептори и/или надолу по веригата вътреклетъчни сигнални пътища (Gunter et al., 2015; Renehan et al., 2015; Murphy et al., 2018).

Неотдавнашното развитие на мощни „омически“ технологии [геномика, транскриптомика (Chen et al., 2007), протеомика (Sun et al., 2018), метиломика (Gaunt et al., 2016; Richmond et al., 2016), метаболомика (Shin et al., 2014; Würtz et al., 2014), липидомиката, микробиомиката (Wang et al., 2018)] отвори нови пътища в хранителните науки към прецизно хранене. В контекста на рака, заедно с химиотерапията и/или лъчетерапията, използвана в клиниките, прецизното хранене може да помогне чрез използването на естествени екстракти, биоактивни съединения и хранителни препоръки за модулиране на генната експресия и/или свързаните с рака рискови фактори като като затлъстяване, което ще окаже влияние върху риска от развитие на това заболяване или неговото прогресиране.

Успехът на такива хранителни интервенции изисква няколко стъпки: (i) инвитро и предклинична демонстрация на антитуморалните ефекти на избрани екстракти и/или биоактивни съединения; (ii) знанията за техния механизъм на действие и молекулярните цели, които ще идентифицират конкретните подгрупи на пациентите, които ще се възползват от тях; (iii) изследване на генетични варианти, свързани с диференциалните реакции на интервенцията; и (iv) новаторски подходи на нови формулировки за подобряване на in vivo бионаличност на биоактивните съставки. Допълнителни фактори като чревния микробиомен състав, имунната система и хранителния статус ще подобрят крайния резултат.

Използването на фитохимикали и съединения, получени от храната, за профилактика и/или лечение на рак е добре демонстрирано (Mouhid et al., 2017; Pan et al., 2017; Kumar et al., 2018; Imran et al., 2019; Tarasiuk и Fichna, 2019), като таксол и камптотецин, които се използват широко в клиниките (Denda et al., 2019; Sanoff et al., 2019; Ulusakarya et al., 2019). Препрограмирането на метаболизма при рак не само подпомага разпространението, но също така насърчава злокачествеността и разпространението на раковите клетки. В тази връзка изостреното усвояване на глюкоза (ефект на Варбург) от пролифериращи ракови клетки (Hanahan and Weinberg, 2011; Derle et al., 2018), повишената глутаминолиза, подпомагаща пролиферацията и редокс хомеостазата (Li и Le, 2018; Bott et al ., 2019) или промени в липидния метаболизъм, свързани с разпространението на рак (Currie et al., 2013; Luo et al., 2018; Munir et al., 2019) са добре документирани.

Един от най-популярните източници на биоактивни съединения са зеленчуците и растенията. Фитохимикалите упражняват важни биологични дейности, като противовъзпалително, антихипертензивно, антиоксидантно, антикарциногенно, антидиабетно или затлъстяване.

Поради тези причини понастоящем се полагат усилия за разработване на иновативни методологии за получаване на биоактивни съединения и/или природни екстракти. В рамките на най-обещаващите методи е зелената технология на свръхкритичните течности, със специално използване на свръхкритичен CO2 при извличането на съединения с ниска полярност. Тази технология може да бъде подпомогната от различни съразтворители, за да се увеличи ефективността на екстракцията.

Тук сме изследвали антитуморалните свойства и механизма на действие на свръхкритичен CO2 екстракт от Невен лекарствен, широко известен като невен, в контекста на рак на панкреаса.

Ракът на панкреаса води до втората позиция на смъртните случаи, свързани с рака в световен мащаб. Този рак има лоша прогноза, а общата 5-годишна преживяемост е + от митохондриалното междумембранно пространство (7–9 измервания) и по този начин за активиране на максимално дишане. И накрая, антимицин А и ротенон (0.5 μM) бяха добавени, за да инхибират напълно митохондриалното дишане (10-12 измервания).

Измерване на клетъчно съдържание на АТФ

За количественото определяне на съдържанието на АТР е използван ATP-базиран анализ CellTiter-Glo, комплект за луминисцентна клетъчна жизнеспособност (Promega, Madison, WI, USA; Cat. # G7571), следвайки препоръките на производителя. Накратко, клетките на MiaPaca-2 бяха предварително обработени (48 часа) с невен SFE при ½ × IC50, 1 × IC50 и 2 × IC50, като IC50 беше равен на 39,8 (± _4,6) μg/ml, както беше описано по-рано (Mouhid и др., 2018). Необработените клетки се държат като контроли. Общо 10 000 клетки на MiaPaca-2 бяха поставени в 96-добре прозрачни дънни плочки от черен полистирен.

Западно петно

След 48 часа лечение с невен SFE, раковите клетки на панкреаса MiaPaca-2 или Panc-1 се промиват и отделят с помощта на трипсин. RIPA буферът с протеазни и фосфатазни инхибитори се използва за лизиране на клетките. След центрофугиране (12 000 g) в продължение на 10 минути при 4 ° С, супернатантите се възстановяват. Протеините бяха денатурирани и заредени в 4-15% Mini-Protean TGX сглобяем протеинов гел (BioRad) за електрофоретично разделяне и прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана. Мембраните бяха блокирани, използвайки 5% сухо мазнини без мазнини в TBS 0,05% Tween-20. Първичните антитела се инкубират за една нощ при 4 ° С, а вторичните антитела се инкубират за 1 час. Като контрол на натоварването се използва оцветяване с β-актин или понсо. Използваните първични антитела са заешки поликлонални анти-LC3 (PM036, разреждане 1: 1000, MBL), заешки моноклонални анти-фосфо-AMPKα (T172) (40H9, 1: 1000 разреждане, клетъчна сигнализация) и заешки моноклонални анти-AMPKα антитела (23A3, разреждане 1: 1000, клетъчно сигнализиране). За контрол на натоварването се използва оцветяване с β-актин (Sigma-Aldrich) или Понсо. Сигналите бяха визуализирани с помощта на ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, Великобритания).

Имунофлуоресценция

Клетките на MiaPaca-2 бяха разпределени в кладенци M24 върху стъклени покривни стъкла за o/n. След това клетките бяха третирани с различни дози невен SFE (1 × IC50, 2 × IC50) в продължение на 48 часа. Необработените клетки се държат като контрола. Клетките се фиксират в 4% PFA/PBS за 10 минути при RT. След това клетките се проникват със 100 μg/ml дигитонин в продължение на 20 минути при RT. След измиване с PBS се добавя анти-LC3 антитяло (1: 1,000) и се инкубира в продължение на 1 час при RT. След измиване, 1: 500 Alexa Fluor 488 Goat Anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11008) се инкубира в продължение на 30 минути при RT. DAPI се инкубира в продължение на 5 минути при RT. Положителните контроли бяха инкубирани в продължение на 6 часа в разтвор на Hank при 37 ° С. Обработките с E64d и пепстатин А се извършват съответно при 10 μM и 10 μg/ml.

Количествена верижна реакция на полимераза в реално време

Клетките на MiaPaca-2 и Panc-1 (0,35 × 106 клетки) се третират с невен SFE в продължение на 48 часа при различни дози: ½ IC50, 1 × IC50, 2 × IC50, като стойностите на IC50 са равни на 39,8 μg/ml (± _4.6) и 43.2 μg/ml (± 7.9), съответно, за MiaPaca-2 и Panc-1, както е описано по-рано (Mouhid et al., 2018). Необработените клетки се държат като контроли.

Общата РНК се екстрахира с три реагента (Sigma). Един микрограм РНК се транскрибира обратно със системата Master Mix RNA-to-cDNA Master Mix (Life Technologies). Количествена полимеразна верижна реакция (qPCR) беше извършена в 7900HT PCR система в реално време (Life Technologies) с помощта на VeriQuest SYBR Green qPCR Master Mix (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и бяха използвани сонди Taqman: Hs01629120_s1, Hs01029413_m1, Hs00245183_m1 и Hs99999901_s1 за BMP8B, TFAP2A, ZFP36L1, и 18S, съответно; или олиго в случай на преход от епител към мезенхим (EMT), стъблови и ендоплазмени ретикулуми (ER) маркери на стрес (Таблица S1 показва списъка и последователностите на използваните праймери). Методът 2 ΔΔCt беше приложен за изчисляване на относителната генна експресия (Livak и Schmittgen, 2001).

Анализ на експресията на гена на микрочипове

Клетките на MiaPaca-2 се посяват (2 × 106) в p100 плаки и 12 часа по-късно се третират в продължение на 48 h с 30 и 70 μg/ml невен SFE. Необработените клетки се държат като контроли. Общата РНК беше изолирана с RNeasy Mini Kit (Qiagen Iberica). Анализът на генната експресия на микрочипове между контролни и третирани клетки се извършва от Геномната служба на Националния център по биотехнологии (CNB-Мадрид, Испания). След валидиране на целостта на РНК, РНК бяха обратно транскрибирани и флуоресцентно маркирани с едноцветния комплект за бързо маркиране с нисък вход (Agilent Technologies). Използваната платформа за експресия на генни микрочипове е Agilent Sure Print G3 Human 8 × 60 K (комплект от цели човешки геном Microarray).

BMP8B Изчерпване с si-RNA-пулове

Клетките (0,25 × 10 6) бяха поставени в плаки с шест ямки с si-RNA пулове (siTOOLs Biotech GmbH, Planegg, Германия) срещу човека BMP8B иРНК за временно изчерпване на експресията на BMP8B. Lipofectamine RNAimax беше използван (Life Technologies, Дармщат, Германия) за трансфекция на ракови клетки на панкреаса MiaPaca-2 и Panc-1 за 4 до 6 часа. След това клетките бяха третирани с посочените дози невен SFE в продължение на 48 часа. Клетките, трансфектирани с отрицателен контрол siPOOL срещу последователности, които не са открити при хора, се държат като контроли. Функционалната роля на BMP8B изчерпването на клетъчната биоенергетика беше допълнително анализирано.

Анализи за нашествие

Камерите, покрити с матригел (BD Biosciences Madrid, Испания) бяха използвани за анализи на инвазия. Изображенията са получени с микроскопа Olympus CKX41. Анализът е направен със софтуера GETIT.

Статистически анализ

Данните за експресия на генни микрочипове са анализирани със софтуера FIESTA (версия 1.0) Статистическите анализи са извършени с помощта на Limma (Smyth, 2005). A P двукратна промяна в сравнение с контролните клетки, са изброени на фигура 6А. Чрез количествен анализ на PCR в реално време (RT-qPCR), повишеното регулиране на BMP8B след третиране с невен SFE по дозозависим начин беше потвърдено (30 и 70 μg/ml) (Фигура 6В, ляв панел). Получихме подобни резултати с друга клетъчна линия на рак на панкреаса, Panc-1, която е описана като по-агресивна в сравнение с клетките на MiaPaCa-2 (Yang et al., 2011) (Фигура 6В, десен панел).

Фигура 6. BMP8B е молекулярна цел на невен SFE. (А) Данни от микрочипове на диференциално експресирани гени след лечение на клетъчна линия на рак на панкреаса MiaPaCa-2 с 30 и 70 μg/ml невен SFE за 48 часа. Данните представляват стойността на най-значимата сонда за три независими експеримента за всяко условие. Гени със статистически значима разлика (P стойност # Показва статистически разлики между siRNA BMP8B и siRNA трансфектирани клетки за всяко състояние: # P ## P ### P #### P Ключови думи: прецизно хранене, свръхкритичен екстракт, невен, клетъчна биоенергетика, рак

Цитиране: Gómez de Cedrón M, Mouhid L, García-Carrascosa E, Fornari T, Reglero G и Ramírez de Molina A (2020) Свръхкритичен екстракт от невен като потенциален ко-адювант при рак на панкреаса: Енергийната катастрофа, предизвикана чрез BMP8B, завършва с индуцирана от автофагия клетъчна смърт. Отпред. Bioeng. Биотехнол. 7: 455. doi: 10.3389/fbioe.2019.00455

Получено: 06 август 2019 г .; Приет: 19 декември 2019 г .;
Публикувано: 24 януари 2020 г.

Арнолдо Лопес-Ернандес, Университет на Уисконсин-Мадисън, САЩ

Нопол-Лексавасди, Университет Чианг Май, Тайланд
Моника Алварес, Испански национален център за изследване на рака, Испания