Роли Куриране на данни, Официален анализ, Изследване, Методология, Визуализация

диетични

Отделение за ветеринарни клинични науки, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, писане - преглед и редактиране

Присъединително училище по биология и ветеринарна медицина, Университет в Камерино, Мачерата, Италия

Роли Куриране на данни, разследване

Отделение за ветеринарни клинични науки, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Отделение за биомедицински науки, Колеж по ветеринарна медицина, Държавен университет в Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Отделение за ветеринарна диагностика и производствена медицина на животните, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, Формален анализ

Отделение за ветеринарна патология, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Отделение за ветеринарна диагностика и производствена медицина на животните, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Писане на роли - преглед и редактиране

Отделение за ветеринарни клинични науки, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Проверка на роли, визуализация, писане - преглед и редактиране

Отдел за биомедицински науки, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, Куриране на данни, Официален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Надзор, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

Отделение за ветеринарни клинични науки, Колеж по ветеринарна медицина, Университет на Айова, Еймс, Айова, Съединени американски щати

  • Тод Етерли,
  • Джакомо Роси,
  • Робин Уайт,
  • Йон-Юнг Со,
  • Чонг Уанг,
  • Марк Акерман,
  • Мери Бройер,
  • Карин Алънспах,
  • Джонатан П. Мохел,
  • Алберт Е. Йергенс
  • Член
  • Автори
  • Метрика
  • Коментари
  • Медийно покритие
  • Партньорска проверка

Фигури

Резюме

Флуоресценция in situ хибридизация (FISH)

Фиксирани с формалин илеални и дебелочревни чревни биопсични проби (3 μM дебели тъканни секции) са монтирани на стъклени предметни стъкла и са оценени от FISH, както е описано по-горе. [17, 18] Накратко, вградените в парафин тъканни проби са депарафинизирани с помощта на автоматизирана система чрез преминаване чрез ксилол (3 х 10 минути), 100% алкохол (2 х 5 минути), 95% етанол (5 минути) и накрая 70% етанол (5 минути). След това диапозитивите бяха транспортирани в дейонизирана вода до лабораторията за тестване на ДНК, където бяха изсушени на въздух преди хибридизацията. FISH сонди, маркирани 5’ или с Cy-3, или с FITC (Life Sciences), бяха възстановени с вода без ДНКаза и разредени до работна концентрация от 5 ng/μL (Таблица 1).

За общия брой на бактериите се използва сонда, маркирана с Eub338 FITC. За други анализи специфични сонди, насочени към Bifidobacteria, Faecalibacteria, Enterobacteriaceae, Lactobacilli и Streptococci, бяха маркирани с Cy-3 и бяха приложени едновременно с универсалната бактериална сонда Eub338-FITC. Този панел от сонди е избран за идентифициране на специфични бактериални групи и отделни бактериални видове, за които по-рано е доказано, че са от значение за патогенезата на кучешки IBD. [8, 9] Тъканите се къпят в 30 μL смес от ДНК-сонда в хибридизационна камера, поддържана при 54 ° С през нощта (12 часа). Измиването се извършва с помощта на промивен буфер (буфер за хибридизация без SDS), предметните стъкла се изплакват със стерилна вода, след това се оставят да изсъхнат на въздух и се монтират с монтажна среда SlowFade Gold (Life Technologies, Carlsbad, CA) и покривно стъкло 25X25-1 (Fisher Scientific, Питсбърг, Пенсилвания).

Специфичността на сондата е потвърдена в пилотни проучвания чрез комбиниране на неподходящата сонда non-Eub338-FITC с Eub338-Cy-3 и чрез експерименти за хибридизация с чисти изолати на бифидобактерии, фекалибактерии, ентеробактерии, лактобацили и стрептококи, за да се провери за неселективна хибридизация.

Количествено определяне на чревни лигавични бактерии

Чревните бактерии се визуализират чрез оцветяване с FISH и 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), като се използва маслена обектив 60x Plan Apo заедно с опционална 1,5-кратна мултипликационна леща на флуоресцентен микроскоп Eclipse TE2000-E (Nikon Instruments Inc., Melville NY) и снимани с камера CoolSnap EZ (Photometrics, Tuscon, AZ), контролирана от софтуера MetaMorph (Nashville, TN). Количественото определяне се извършва само когато хибридизационните сигнали са силни и могат ясно да разграничат непокътнатите бактерии морфологично чрез 2-цветна (универсална и бактериално-специфична FISH сонда) или 3-цветна (FISH сонди и DAPI петно) идентификация.

Изследвани са минимум 4 различни ендоскопски биопсични проби на куче (2 илеални и 2 възходящи и/или трансверсни биопсии на дебелото черво) за тяхното лигавично бактериално съдържание. Чревните тъкани (ендоскопски биопсии на илеум и дебело черво) за анализ на FISH се комбинират върху стъклени стъкла за улесняване на хибридизацията и последователност на интерпретацията от един оператор. По този начин едно стъкло ще съдържа тъкани на илеята и дебелото черво (3-5 проби от всяка тъкан), в които операторът ще извърши 10 отделни бактериални преброявания в отделни ендоскопски проби. Докато се полагаше грижа за точното разграничаване на пробите от лигавицата на лигавицата и дебелото черво за количествен анализ, не винаги може да се определи ясно разграничение между тези тъкани. Следователно, броят на бактериите на лигавицата за всяко животно е регистриран като кумулативен сбор от бактерии, наблюдавани в чревните сегменти на илеалната/дебелото черво, както е описано по-горе. [19]

Количественото определяне на бактериите се извършва в 10 представителни полета/куче при последно наблюдавано увеличение от 600x или 900x. Десетте полета включваха бактерии, открити в 4 добре дефинирани лигавични отделения: (1) бактерии, съдържащи се в лигавицата, (2) бактерии, прикрепени към повърхностния епител, (3) бактерии, локализирани в прилепналата слуз, и (4) бактерии, открити в свободната слуз.

Статистически анализ

Размерът на пробата от регистрирани кучета с IBD е продиктуван от продължителността на времето, предоставено на проспективното клинично изпитване. През този период други кучета (n = 6) са диагностицирани с IBD, но не са записани поради невъзможност да получат информирано съгласие на клиента или неспособност на клиентите да се придържат към специфични препоръки за лечение.

Мукозните бактерии в контролната група (здрави кучета) са сравнени с болестната група (кучета с IBD), като се използват тестове на Wilcoxon rank-sum (или Mann-Whitney). Разликите в броя на бактериите между лечението преди и след преднизон бяха оценени с помощта на теста на Wilcoxon с ранг. За анализ на броя на клетките, експресиращи TJP, бяха проведени Wilcoxon rank-rank и сдвоени t-тестове с две проби, за да се изследват статистически значими разлики между здрави кучета и кучета с IBD преди лечението и между броя преди и след лечението при IBD кучета, съответно. Анализите на данните бяха извършени с помощта на R статистически софтуер (версия 3.5.2; The R Foundation for Statistical Computing, Виена, Австрия). P-стойности Таблица 2. Клинични характеристики на изследваните животни.

Свързаната с лигавицата микробиота на здрави и болни кучета е най-много в свободна и прилепнала слуз (таблици 3 и 4; таблици S1 и S2). Популации от бактерии, хибридизирани със сонди, насочени срещу Bifidobacterium spp., Faecalibacterium spp., Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae и Streptococcus spp. Няма значителна разлика в броя и пространственото разпределение на различните бактериални видове в лигавицата (т.е. прикрепване към повърхностния епител или инвазия в тъканите) нито за HC кучета, нито за кучета с IBD. По същия начин общият брой на Eub338-положителни бактерии не се различава значително при диагностициране или след медицинско лечение при кучета с IBD в сравнение с HC кучета. Увеличени са само лактобацилите (

8 пъти, P Фигура 1. Тройният цвят FISH идентифицира лигавичните бактерии в прилепналото отделение на слуз при кучета с IBD след преднизон и диетична терапия.

Панели A-C = илеални тъкани и панели D-F = тъкани на дебелото черво. Панел A = сонда Cy3-Faecali698; Панел В = сонда Cy3-Ebac; Панел С = сонда Cy3- Strc493; Панел D = сонда Cy3-Bif164; Панел E = Cy3-Ebac; Панел F = сонда FITC-Eub338. Всички други бактерии, които хибридизират изключително с универсалната сонда (Eub338-FITC), изглеждат зелени. DAPI-оцветената чревна лигавица с бокалови клетки изглежда синя. Всички изображения с увеличение 600x.

Разлики (P Таблица 3. Общо количество бактерии чрез FISH (във всички отдели на лигавицата).

Интензивността на оцветяване и разпределението на експресията на AJP на илеалната и дебелото черво е подобна на предишни проучвания. [16, 19] IHC маркирането за всички протеини на апикална връзка е най-интензивно по апикалната част на епителните клетки както в илеалната, така и в дебелото черво (Фигура 3) . Наблюдавани са разлики в чревните епителни бариерни протеини с повишена експресия на AJP оклудин (

5 пъти, P Фигура 3. Имунохистохимична експресия на AJP при биопсии на дебелото черво на кучета с IBD след преднизон и диетична терапия.

Експресията на протеин се определя въз основа на броя на клетките и интензивността на оцветяване на AJPs в лигавицата. Ляв панел = Claudin-2; централен панел = E-кадхерин; десен панел = оклудин. Вижте Таблица 3 за сравненията на AJP между кохортите на кучета.

Дискусия

Мукозната микробиота при кучета с IBD, лекувани с хидролизирана диета и орален преднизон за индукция на ремисия, беше надлъжно изследвана с помощта на FISH. Това проучване е уникално, тъй като сравнява лигавичната микрофлора при HC кучета с лигавични бактериални популации при кучета IBD преди и след диета и приложение на GC. Установихме, че кучетата с IBD имат увеличен брой лактобацили в сравнение с HC кучета. Промени в състава и пространственото разпределение на лигавичните бактерии се наблюдават при IBD кучета след GC и диетично лечение, с повече Bifidobacterium spp., Faecalibacterium spp. и Streptococcus spp. намерени в прилепналото отделение за слуз. Мукозната експресия на различни епителни AJP варира с повишени нива на оклудин и Е-кадхерин, но намален зонулин, наблюдаван при чревни биопсии на кучета с IBD след преднизон и диетична терапия.

Има изобилие от клинични доказателства, които показват промени в чревната микробиота в патогенезата на IBD. [4, 6] Характерните промени в състава при пациенти с IBD при хора включват намалено микробно разнообразие с увеличен брой предполагаеми вредни бактериални групи (Enterobacteriaceae, включително Escherichia coli [E. coli] и Fusobacterium spp.), Съчетани с намаляване на защитни видове като Lachnospiraceae, Bifidobacterium spp., Roseburia и Faecalibacterium prausnitzii. [5, 20, 21] Има много малко данни, описващи микробиома на придружаващите животни с повечето данни, получени от анализа на изпражненията. Съобщаваните микробни отмествания при кучета при болестни състояния включват по-ниско изобилие от Fusobacteria, Bacteroidetes и Clostridiales, но по-голямо изобилие от протеобактерии в дуоденални циторазресвания и проби от дуоденална биопсия. [7, 22] В отделни проучвания, FISH техники са идентифицирали инвазивни E. coli при биопсии на дебелото черво на кучета с грануломатозен колит [23, 24] и увеличени свързани с лигавиците ентеробактерии (Е. coli) в илеум/дебело черво на кучета с лимфоцитно-плазмоцитен ентероколит [9, 19].

Кучешката хронична ентеропатия, която не реагира на диета и антимикробни интервенции, се определя като идиопатична IBD, което се потвърждава от резултатите от чревна биопсия, показващи възпаление на лигавицата. В тези случаи лечението обикновено изисква имуносупресивни лекарства, като системните GCs често се използват в повечето режими на лечение. [12] Отделни рандомизирани контролирани проучвания осигуряват сериозни доказателства за прилагане на перорални GC (т.е. преднизон, преднизолон и будезонид) като индукционна терапия за кучета с IBD. [11, 25] Още други проучвания препоръчват засилващ се подход, като първо се използва преднизон и след това се добавят други имуносупресивни средства, ако е необходимо, за пациенти без реакция и пациенти с тежко клинично заболяване. [26] Подобна стратегия се използва при IBD при хора, където системните GC се прилагат като терапия от първа линия за индуциране на ремисия на леко-умерен илеит/колит на Crohn и тежък улцерозен колит. [27, 28]

Още други проучвания са оценили ролята на глюкокортикоидите при преоформянето на чревната микробиота при хроничен ентероколит. Използвайки генетично чувствителен миши модел на колит, хроничното (28 дни) приложение на дексаметазон променя състава на фекалната микробиота (т.е. повишен Bifidobacterium spp. И Lactobacillus spp.) И насърчава забележимото отсъствие на Mucispirillum spp., Чревен микроб разчита на муцин. [33] В едно малко проспективно рандомизирано клинично изпитване 19 деца, наскоро диагностицирани с активен CD, са били лекувани или с ентерално хранене (EN), или с кортикостероиди (CS) за индукция на ремисия. Докато както EN, така и CS предизвикват клинична ремисия след 8 седмици непрекъсната терапия, пациентите, лекувани с EN, показват промяна в състава на фекалната микробиота до по-висок дял на бактериите Ruminococcus (с по-висок процент на бактерии, принадлежащи към Clostridium spp.) В сравнение с Кохорта, лекувана с CS. [34]

Едно проучване е оценило чревната лигавична микробиота при кучета с идиопатична IBD или диария, отговаряща на храната (FRD) преди и след лечението. [35] Ендоскопските биопсии на дванадесетопръстника и дебелото черво са получени от 24 кучета (15 FRD, 9 IBD) и са оценени чрез секвениране Illumina на бактериалния 16S rRNA ген. Кучета с IBD са лекувани с елиминираща диета и преднизолон (1 mg/kg два пъти дневно) в продължение на 14 дни. Резултатите не успяха да разкрият значителни разлики в общото видово богатство на кучета с IBD спрямо FRD. При сравняване на ефекта от лечението върху състава на микробиотата, дванадесетопръстникът на кучета с FRD е обогатен с Enterococcus spp., Corynebacterium spp. и предварителна обработка с протеобактерии, докато Bacteroides spp. е в изобилие в дебелото черво на кучетата с IBD след лечение.

Нашите резултати, използващи FISH, потвърдиха значителни промени в пространственото разпределение на избрани лигавични бактерии (т.е. общи бактерии и тези бактериални субпопулации, насочени от 5-те различни олигонуклеотидни сонди, използвани в настоящото проучване) при кучета с IBD спрямо HC кучета и в IBD кучета, получаващи преднизон и диетично лечение. Тези данни установяват, че глюкокортикоидите, прилагани при кучета с IBD, променят разпределението и състава на някои от лигавичните микробиоти (т.е. повишен брой на Bifidobacteria, Faecalibacteria и Streptococci) в прилепналата слуз на илеалната и дебелото черво тъкани, което може да допринесе за индуциране на ремисия. Основните ограничения в по-ранното проучване на кучетата, проведено от други в сравнение с нашия доклад, включват: i) отсъствието на здрава контролна група кучета; ii) липса на описание на критериите за клинична ремисия и отговори на групата на лечение, свързани с промени в микробния състав; iii) невключване на илеални биопсии за микробен композиционен анализ и iv) използване на 16S rRNA генно секвениране, което може да идентифицира широки промени в разнообразието на общността, но не предоставя информация за структурата на микробната общност, както и анализа на FISH.

Ясно е, че дисбиозата на чревните бактерии е както причина, така и последица от IBD. Тъй като антибиотиците и пробиотиците имат само скромни ефекти при лечението на пациенти с IBD [4], много клиницисти сега избират терапевтичен подход отгоре надолу, като използват биологични и/или имуносупресивни лекарства, като глюкокортикоиди, за да предизвикат клинична ремисия [26, 36, 37 ]. Само няколко проучвания показват, че GC (или което и да е друго имуносупресивно лекарство по този въпрос) могат да упражняват благоприятни ефекти върху фекалния микробиом (т.е. повишени Clostridia, Bifidobacteria и Lactobacilli) на засегнатите от IBD индивиди. Въпреки това, няма проучвания (извън настоящия доклад), които описват как или защо GCs селективно променят лигавичната микробиота при IBD. Възможно е също така други компоненти на чревния микробиом (т.е. гъбички и вируси) да бъдат повлияни от приложението на GC и да допринесат за благоприятна модулация на резидентните бактериални популации, както се наблюдава в това проучване. [4]