Резюме

Заден план

От фармакологична гледна точка леснодостъпните, добре характеризирани животински модели на сърдечно-съдови заболявания, включително подходящи in vivo маркери на атеросклероза, са важни за оценка на новите кандидати за лекарства. Освен това, като се има предвид въздействието на захарния диабет върху атеросклерозата при хора, включването на този аспект на заболяването в характеристиката на такъв модел е от голямо значение. Целта на това проучване е да се оцени ефектът от лекия диабет, индуциран от стрептозотоцин върху ex- и in vivo крайни точки в модел на атеросклеротична мини-свиня, предизвикан от диета.

Методи

Кастрираните мъжки мини свине от Гьотинген са били хранени със стандартна чау (CD), само с атерогенна диета (HFD) или с насложен диабет, индуциран от стрептозотоцин (HFD-D). Циркулиращите маркери на възпалението (С-реактивен протеин (CRP), оксидиран липопротеин с ниска плътност (oxLDL), инхибитор на плазминогенов активатор-1, метаболизъм на липиди и глюкоза бяха оценени заедно с коронарната и аортна атеросклероза след 22 или 43 диетични седмици. бяха оценени чрез дисперсионен анализ за параметрични данни и тест на Крускал – Уолис за непараметрични данни. За качествени оценки беше приложен точен тест на Фишер. За всички анализи, p

Заден план

При проучвания на атеросклеротични прасета, независимо дали е предизвикан диабет или не, многократната оценка на атеросклерозата е от значение, особено когато се изследват потенциалните лекарствени ефекти. В допълнение към традиционните маркери на риска, като повишен общ плазмен холестерол и фракции на холестерола, плазмените маркери на възпалението все повече се използват за подобряване на прогнозирането на резултатите от сърдечно-съдови заболявания [18, 19]. Съответни възпалителни маркери, напр. Предполага се, че С-реактивният протеин (CRP) и окисленият липопротеин с ниска плътност (oxLDL) участват в възпалението на ендотелните клетки, както и че механично участват в образуването на атерома [20, 21]. Други маркери, като тъканния плазминогенен активатор и инхибитора на плазминогенов активатор-1 (PAI-1), се отнасят до хемостазата и нарушената фибринолиза и особено PAI-1 е признат като показател по отношение на тромбогенността на атеросклеротичните плаки [19, 22]. Това може да са подходящи биомаркери за атеросклероза при свине, както и при хора, но се нуждаят от допълнителни изследвания.

Целта на това проучване е да се оцени ефектът от лекия диабет върху аортната и коронарната плака и напредъка на лезиите при индуцирани от диета атеросклеротични и леко диабетни мини свине от Гьотинген. В допълнение, връзката между тежестта на плаката и циркулиращите метаболитни и възпалителни маркери, относими към атеросклерозата, беше оценена при животни, евтаназирани след 22 или 43 седмици на атерогенно диетично хранене.

Методи

Животни, диета и настаняване

Кастрираните мъжки мини свине от Гьотинген (Ellegaard A/S, Dalmose, DK), бяха настанени в изследователски съоръжения на Университета в Копенхаген. Използвайки разпределен дизайн, две кохорти (A и B) с еднакво разпределение на животните във всяка кохорта, средна възраст 11 седмици в началото на изследването, бяха рандомизирани в три групи; постно управление (CD, n = 12) хранени със стандартна диета с мини свине (Mini-pig, Testdiet, Essex, UK) според препоръките на животновъдите и група с високо съдържание на мазнини/висок холестерол (HFD, n = 12), както и нискостепенна диабетна група (HFD-D, n = 12), и двете хранени с атерогенна диета с 2% холестерол и 0,7% натриев холат (атеросклеротична диета Ossabaw тип 5B4L, TestDiet ®, Сейнт Луис, МО, САЩ). Всички животни са били хранени с общо дневно количество от 2–2,5% от телесното тегло (оценява се седмично), разделено на две дневни хранения. Животните имаха свободен достъп до вода и постелки и бяха настанени в групи, с изключение на периоди с имплантирани интравенозни (IV) катетри. Животните от всяка кохорта бяха евтаназирани в два различни времеви момента: След 22 седмици диетично хранене на средна възраст 33 седмици (CD, n = 6 и HFD, n = 6) или 43 седмици диетично хранене на средна възраст от 55 седмици (CD, n = 6, HFD, n = 6 и HFD-D, n = 12). Изследването е одобрено от Инспекцията за опити с животни, Министерство на правосъдието, DK.

Част от животните в настоящото проучване са описани по-рано в Pedersen et al. [23] и Christoffersen et al. [24].

Индукция на диабет

Лекият диабет се индуцира съгласно предходните протоколи [17], като се използва единична висока IV доза стрептозотоцин (125 mg/kg), предшествана от IV доза никотинамид (67 mg/kg). Една група животни (всички в кохорта А) бяха индуцирани два пъти, на възраст 16 и 30 седмици (HFD-DA, n = 6), поради намаляващия ефект на първата индукция, другата група (всички в кохорта В) беше индуцирана веднъж на възраст 40 седмици (HFD-DB, n = 6). За проследяване на нивата на глюкоза (GLU) и фруктозамин (FRA), плазмените проби се оценяват на всеки 4–6 седмици. Ежеседмично GLU на кръвта се оценява от капилярна кръв на ухото, като се използва ръчно устройство (Accu-Chek ® Aviva Nano, Roche Дания, Hvidovre, DK) (данните не са показани).

Оценки in vivo

Тестове за интравенозен глюкозен толеранс (IVGTT) бяха извършени преди времевите точки на евтаназия за оценка на индекса на интравенозна глюкозна толерантност (KG) и инсулиновия отговор (площ под кривата на инсулина, AUCInsulin). Съставът на тялото беше оценен с помощта на двуенергийна рентгенова абсорбциометрия (DXA). Плазмените проби преди евтаназия бяха оценени за липидни параметри (триглицериди, TG; общ холестерол, TC; липопротеин с ниска плътност, LDL; липопротеин с висока плътност, HDL; липопротеин с много ниска плътност, VLDL), свързани с глюкозата (FRA и GLU) . Възпалителните параметри бяха оценени от плазмени проби преди евтаназия (oxLDL) и серумни и плазмени проби, взети 6 седмици преди евтаназия (CRP и PAI-1), и анализирани, както е описано по-долу. За да се избегне потенциалното влияние на имплантацията на IV-катетър върху CRP и PAI-1, тези маркери са анализирани от кръв, взета проба преди имплантацията на IV-катетър.

Възпалителни параметри

Използвайки наличен в търговската мрежа ELISA-комплект (Mercodia AB, Uppsala, Швеция), oxLDL беше оценен в плазма, с миши моноклонални антитела (mAb 4E6), срещу конформационен епитоп при окисления аполипопротеин B100 на oxLDL [25]. CRP се оценява от серум, като се използват установени протоколи, чрез дендример-свързан цитидин дифосфохолинов сандвич имуносорбентен анализ, свързан с ензими (ELISA) [26]. PAI-1 се оценява от стабилизирана с натриумцитрат плазма, използвайки наличен в търговската мрежа ELISA-комплект (CSI19905A, Cell Sciences ®, Canton, MA, USA), с моноклонално анти-човешко PAI-1 антитяло. Всички проби бяха проведени в два екземпляра, отчитащи средни стойности [среден коефициент на вариация от 5% (диапазон 0–20%)].

Ex vivo оценки: хистология и en face оценки

След евтаназия, сърцето е събрано и левият преден низходящ клон на лявата коронарна артерия (LAD) е разделен на напречни сегменти, за хистоморфометрична оценка на тежестта на плаката. Бяха оценени абсолютната зона на интимата (коронарна плака, CPA) и относителната площ на плаката (съотношение интима/медия, съотношение). Площта на лицевата плака (площ на аортната плака, APA) беше оценена от цялата аорта. Освен това сеченията на LAD и аортата, оцветени с пентахрома на Movat или оцветяването на Verhoeff Van Gieson, са оценени качествено за тежестта на лезията, за да се направи разлика между непатологични и патологични удебелявания на интимата, оценени съгласно модифицирани насоки от Virmani et al. [10, 27, 28].

Моля, вижте Допълнителен файл 1: допълнителни методи, за повече подробности.

Статистика

В статистическите модели целта беше да се оценят общите групови разлики на всички количествени и качествени мерки и ефекта на циркулиращите маркери върху CPA, APA и съотношението.

Групови разлики

CPA Ratio, APA и циркулиращи маркери Цялостните групови разлики на CPA, Ratio, APA и циркулиращите маркери бяха оценени чрез използване на анализ на дисперсията (ANOVA) с кохорта (A, B), период на диетично хранене (22 или 43 седмици) и група (CD, HFD, HFD-DA, HFD-DB) като променливи на класа. Ако се установи обща статистическа значимост, се анализират специфични групови разлики, като се използва post hoc тест на Tukey – Kramer с стр стойности, коригирани за многократно тестване. Остатъчните количества бяха оценени за нормалност и съответно трансформирани, а при липса на хомогенност на остатъчните вещества беше приложен тест на Крускал-Уолис с Wilcoxon Rank-sum post hoc тест.

Качествена оценка на LAD и аортни лезии Въз основа на качествени находки от хистологията от LAD и аорта, груповите разлики бяха оценени след 43 диетични седмици и илюстрирани графично. Освен това, за да се оцени ефектът от продължителността на проучването върху прогресията на аортната и LAD лезия, не-атеросклеротичните интимни лезии и прогресиращите атеросклеротични лезии са оценени само при HFD, след 22 и 43 седмици на диета. Груповите различия бяха оценени с помощта на точен тест на Фишърс с p

Резултати

Характеристиките на фона на животните са представени в Таблица 1. Едно животно умира преждевременно от неизвестна причина (HFD-DB, n = 1), друго показва тежко съдово възпаление, диагностицирано хистопатологично като полиартериит нодоза, несъвместимо с проучвания за атеросклероза (HFD, n = 1) . При HFD и HFD-D се наблюдават увеличени бледи черни дробове при евтаназия в сравнение с CD. В предишни проучвания, прилагайки подобна диета при прасета, са наблюдавани чернодробни макро- и микроскопични промени, сравними с безалкохолния стеатохепатит при хората [29].

Лек диабет

На фиг. 1 плазмените нива на GLU и FRA във времето са графично илюстрирани, с HFD-DA и B в сравнение с CD и HFD, илюстриращи повишени нива на гладно и на двата параметъра в двете групи с диабет в хода на проучването. Прасетата не са получили никакъв екзогенен инсулин и освен това не се наблюдава разлика в BW между групите със затлъстяване, както се вижда в таблица 1.

индуцирана

Илюстрация на плазмената глюкоза (а) и фруктозамин (б) с течение на времето при животни без диабет [постно контролиране (CD) и хранене с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на холестерол (HFD)] в сравнение с двете диабетични групи (HFD-DA, HFD-DB). Диабетът се индуцира два пъти при HFD-DA; след 5 и 17 седмици на диетично хранене и веднъж в HFD-DB, след 26 седмици на диетично хранене. Индукцията на диабет се илюстрира с кърлежи във всяка точка от времето, маркирана с A и Б., съответно. Данните са показани като средна стойност ± SEM. Моля, обърнете внимание, че не всички животни са представени по всяко време

Групови разлики

Циркулиращи маркери, CPA, Ratio и APA

Качествена оценка на LAD и аорта

Примери за непатологични интимни лезии в лявата предна низходяща артерия (LAD) и коремната аорта. Пентахромното оцветяване на Movat. Мащабна лента 500 µm. а LAD, постно контролно животно (CD). б LAD, животно хранено с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на холестерол (HFD); ксантома с богата на протеогликан матрица (стрелка). ° С Aorta, CD. д Aorta, HFD; ксантома

Примери за прогресиращи атеросклеротични лезии в лявата предна низходяща артерия (LAD) и коремната аорта. Пентахромното оцветяване на Movat. Мащабна лента 500 µm. а LAD, животно хранено с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на холестерол (HFD), патологично удебеляване на интимата. Вмъкване холестеролни цепнатини и калцификация. б LAD, HFD, фиброатерома с подчертано калциране. Вмъкване капачка на лезията. ° С Патологично удебеляване на интимата в аортата. Вмъкване зона на калциране. д Фиброатерома в аортата. Вмъкване холестероловите цепнатини нарушават вътрешната еластична ламина и ангиогенезата

Разпределение на интимни лезии в лявата предна низходяща артерия (LAD) (а) и аорта (б) от контрола (CD), хранени с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на холестерол (HFD) и диети с диета с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на холестерол, група A или B (HFD-DA или B), диета седмица 43

Асоциация на циркулиращите маркери с CPA, Ratio и APA

Индивидуално оцененият ефект на циркулиращите маркери (CRP, oxLDL, PAI-1, GLU, FRA, AUCInsulin, KG, TG, VLDL, HDL и LDL) върху CPA, Ratio и APA, разкри само значителна връзка между APA и oxLDL (стр = 0,015). Във връзка с биологично свързания ефект на групирани маркери върху тежестта на плаката се наблюдава положителна връзка между CPA и oxLDL (стр = 0,024) и PAI-1 (стр = 0,048). Не се наблюдава обаче съответна връзка между възпалителни маркери и Ratio. Не се наблюдава ефект на групирани параметри на глюкозата. За групирани липидни параметри TG е положително (стр = 0,0039), докато HDL е отрицателно свързан с APA (стр = 0,0461). Не е установен ефект на липидните параметри върху CPA или Ratio. Груповият ефект остава значителен при всички намалени модели.

Моля, вижте Допълнителен файл 2: допълнителни резултати, за повече подробности.

Дискусия

Във връзка с възпалителните маркери, наличността на съответните антитела все още е предизвикателство, въпреки увеличеното използване на свине в биомедицински изследвания. В това проучване бяха оценени три съответни маркера. Общо повишените нива на oxLDL съответстват на предишни констатации при прасета, като циркулиращият oxLDL се оценява във връзка с ранното образуване на атерома и в проучванията за отнемане от диетата [40, 43]. Въпреки че е установена положителна връзка между APA, CPA и oxLDL, това не се наблюдава между Ratio и oxLDL и следователно трябва да се вземат предпазни мерки при интерпретиране на влиянието на oxLDL върху аортната или коронарната плака.

Въпреки че се наблюдава тенденция PAI-1 да се различава между групите, не се наблюдават значителни разлики, в съгласие с предишни открития при свине [52].

Заключение

В заключение, характеризиран е с диета индуциран минипиг модел на напреднала атеросклероза, включващ няколко транслационни плазмени маркера за оценка на възпалението. Индукцията на лек диабет не ускорява атеросклерозата, но за да се оцени допълнителният ефект на диабет от сърдечно-съдово лекарство в модела, индуцирането на диабет все още може да бъде от значение.