Възпаление

Тази статия е част от изследователската тема

Индуцирана от нано и микрочастици клетъчна смърт, възпаление и имунни отговори Вижте всички 21 статии

Редактиран от
Филип Саас

INSERM U1098 Взаимодействия Hôte-Greffon-Tumeur & Ingénierie Cellulaire et Génique, Франция

Прегледан от
Йосиф И. Шапиро

Университет Маршал, САЩ

Юфен Хуанг

Университетът в Юта, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

гранични

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Отдел по нефрология, Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München, Мюнхен, Германия
  • 2 Предклинична образна платформа Erlangen, Институт по радиология, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Германия
  • 3 Ludwig-Maximilians Universität München, Biomedizinisches Centrum, Мюнхен, Германия
  • 4 Катедра по радиационна онкология, Университет „Лудвиг-Максимилианс“ в Мюнхен, Мюнхен, Германия

Въведение

Терапиите за предотвратяване на бъбречна недостатъчност от CaOx кристално индуцирана нефропатия и/или нефрокалциноза са насочени главно към понижаване на серума и урината оксалат, използването на диета с намален оксалат и добавки с калций при пациенти с ентерична хипероксалурия, както и противовъзпалителни терапии (12). Прогресията на ХБН при нефрокалциноза е свързана с дълбока интерстициална фиброза (13), хистопатологична характеристика на атрофията на бъбреците, за която се смята, че допринася за прогресията на ХБН (14). Трансформиращият растежен фактор (TGF) β е критичен медиатор на фиброза на органи и многократно е валидиран като молекулярна мишена при заболяване (15). Въпреки това, при бъбречна фиброза само няколко проучвания оценяват скоростта на гломерулна филтрация (GFR), клинично значим маркер на бъбречната екскреторна функция, като крайна точка в проучвания с интервенции, моделиращи бъбречна фиброгенеза.

Ние предположихме, че анти-TGFβ IgG може не само да инхибира интерстициалната фиброза, но също така да повлияе на кристализацията на CaOx вътре в бъбреците, която и двете трябва да синергизират, за да предотвратят спада на GFR, свързан с нефрокалцинозата, т.е. прогресия на ХБН. За да се справим с тази концепция, използвахме миши модел на прогресивен CaOx кристално задвижван CKD (13) с превантивно или забавено анти-TGFβ IgG лечение (16, 17).

Материали и методи

Изследвания върху животни

За отложено лечение с IgG1 или анти-TGFβ антитела, всички мишки бяха поставени на контролна диета (н = 5) или богата на оксалати диета (н = 5) и две групи мишки са получили допълнително или контролното IgG1 антитяло (i.p., 1,5 mg/kg BW, н = 5) или анти-TGFβ антитялото (i.p., 1,5 mg/kg BW, н = 5) четири пъти, започвайки от ден 7 всеки алтернативен ден до жертва на ден 14 (Фигура S1 в Допълнителен материал).

Оценка на бъбречна травма

Бъбречни участъци от 2 µm бяха оцветени с Pizzolato, за да се визуализира отлагането на CaOx кристали, което беше количествено (% площ), използвайки ImageJ софтуер, както е описано по-горе (20). Реактивът с периодична киселина-Шиф (PAS) се използва за оценка на увреждане на бъбреците, което се оценява чрез оценка на процента на атрофичните тубули. CD3 + Т клетки и F4/80 + макрофаги (и двата Serotec, Kidlington, UK) бяха идентифицирани чрез имунооцветяване. Фибротичните области бяха идентифицирани чрез имунооцветяване за сребро и α-гладкомускулен актин (α-SMA) (Dako GmbH, Хамбург, Германия). Количественото определяне на имунооцветяването (% площ) беше направено с помощта на софтуера ImageJ. Наблюдател, заслепен от експерименталното състояние, извърши всички оценки. Азот на уреята в серумна кръв (BUN) (DiaSys, Holzheim, Германия), оксалова киселина в серума и урината (оксалат) (Libios, Pontcharra-sur-Turdine, Франция) и калций в урината (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия) бяха измерени с помощта на налични в търговската мрежа комплекти съгласно протокола на производителя.

Транскутанна оценка и изчисляване на GFR

Измерванията на скоростта на гломерулна филтрация бяха извършени при съзнателни мишки на ден 0, 7 и 14 (н = 5 на група). Накратко, мишките бяха анестезирани с изофлуран, за да монтират миниатюризирано устройство за изобразяване, изградено от два светодиода, фотодиод и батерия (MediBeacon ™ Inc., Манхайм, Германия) върху обръснатата врата на животните (21). Фоновият сигнал на кожата се записва в продължение на 5 минути. След това мишките получиха еднократна инжекция на FITC-синистрин (i.v., 150 mg/kg BW) (MediBeacon ™ Inc., Mannheim, Германия). Всяка мишка беше държана в една клетка и сигналът беше записан в продължение на 90 минути. Данните бяха анализирани с помощта на образно устройство MPD Studio софтуер (MediBeacon ™ Inc., Манхайм, Германия). GFR (μl/min/100 g BW) се изчислява от намаляването на интензивността на флуоресценцията на FITC-синистрин с течение на времето, използвайки модела с три отделения с линейна корекция (инжекционен, плазмен и интерстициален отдел, т1/2 от FITC-синистрин), BW на мишката и емпиричен коефициент на преобразуване съгласно протокола на производителя (21, 22). Наклонът на дневната загуба на GFR (м) беше определено с линейното уравнение с помощта на Microsoft Excel

Кристална формация на CaOx Инвитро

Образуването на кристали CaOx инвитро по-рано е описано по-подробно (7). Накратко, 50 µl разтвор на Na2C2O4 (оксалат, 0,1 тМ, рН 7,3) се смесва с 50 µl разтвор на CaCl2 (0,1 тМ, рН 7,3) в 96-гнездова плака при стайна температура (RT) в продължение на 5 минути (само CaOx) . За да се изследва ефекта на IgG1 или анти-TGFβ антитялото върху образуването на кристали CaOx, разтворът на Na2C2O4 беше предварително инкубиран със или без IgG1 или анти-TGFβ антитяло (0.2 µg/ml) или IgG F (ab ′) 2 фрагмент антитяло (0.2 ug/ml) за 1 h при RT преди добавяне на CaCl2 буфер (CaOx + IgG1). Различни форми на кристали CaOx [CaOx монохидрат (COM) и CaOx дихидрат (COD)] бяха визуализирани под микроскопия на Leica и количествено определени с помощта на поточна цитометрия (BD FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA).

Подготовка на РНК и количествена PCR в реално време

Комплектът за екстракция на РНК от Qiagen (Дюселдорф, Германия) е използван за изолиране на общата РНК от бъбреците (н = 5 на група) следвайки инструкциите на производителя. Качеството на РНК се оценява с помощта на агарозни гелове, преди да се транскрибира в cDNA, като се използва обратна транскриптаза (Superscript II) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). RT-PCR в реално време се извършва с помощта на SYBRGreen PCR master mix и се анализира с Light Cycler 480 (Roche, Mannheim, Германия). Всички стойности на генната експресия бяха нормализирани, използвайки 18s rRNA като домакински ген. Всички праймери, използвани за амплификация, са закупени от Metabion (Martinsried, Германия) и са изброени в Таблица 1.

маса 1. Последователности от миши праймери.

Анализ на поточната цитометрия

Ядрено-магнитен резонанс (ЯМР)

Бъбреци от лекувани с IgG1- и анти-TGFβ мишки с нефрокалциноза на 14 ден (н = 4 всяка група) бяха събрани и обработени в 1,5% агарозен гел и поставени в цяла телесна намотка за мишки (Bruker BioSpin, Ettlingen, Германия) на специален скенер за магнитно-резонансен томограф за малки животни (ClinScan 7 T, Bruker BioSpin, Ettlingen, Германия). Стандартни последователности за морфология и картографиране на времената за релаксация на Т1 и Т2 (Siemens, Erlangen, Германия) бяха извършени върху бъбреците в сагитална ориентация. Чрез картографиране на времето за релаксация се определят количествено специфичните магнитни свойства на тъканите. Увеличението на времето за релаксация на Т1 е свързано с фиброза, докато удължените времена на релаксация на Т2 се откриват при възпаление (13). За последваща обработка на изображения, три области от интерес бяха поставени съответно в кората, външната и вътрешната медула, за да се определят времето за релаксация на T1 и T2 (Osirix, Bernex, Швейцария, софтуер с отворен код).

Микромащабна термофореза

MST се използва за характеризиране на афинитета на свързване между IgG1 и разтворим натриев оксалат. Разтворимият оксалат при различни концентрации (1 nM – 5 mM) и IgG1 (250 nM) се инкубират за 1 h при RT. Измерванията бяха извършени с устройството Monolith NT.LabelFree MST, използвайки стандартни капиляри (NanoTemper Technologies, Мюнхен, Германия). Като контроли се използват само буфер, разтворим натриев оксалат или само IgG1. Измерванията се извършват при 25 ° С в 67 mM NaPO4 буфер, 150 mM NaCl и 0,05% Tween 20 при рН 7,4. Инфрачервената лазерна мощност е между 20 и 40% и е използвана 40–70% LED мощност. Използваха се лазер за време от 30 s и време за изключване от 5 s. Данните от тестовете за свързване бяха анализирани с помощта на Nanotemper анализ.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на Student’s т-тест, двупосочен ANOVA с корекция на Bonferroni или еднопосочен ANOVA с сравнение на Tukey и извършен с помощта на софтуера GraphPad Prism5.0. Данните са представени като средно ± SEM. Счита се, че значимостта се постига при стойност от стр Ключови думи: калциев оксалат, кристализация, трансформиращ растежен фактор β, фиброза, нефрокалциноза, хронично бъбречно заболяване

Цитиране: Steiger S, Grill JF, Ma Q, Bäuerle T, Jordan J, Smolle M, Böhland C, Lech M и Anders HJ (2018) Анти-трансформиращ растежен фактор β IgG предизвиква двоен ефект върху кристализацията на калциев оксалат и прогресиращата нефрокалциноза Свързани хронични бъбречни заболявания. Отпред. Имунол. 9: 619. doi: 10.3389/fimmu.2018.00619

Получено: 24 януари 2018 г .; Приет: 12 март 2018 г .;
Публикувано: 29 март 2018 г.

Philippe Saas, INSERM UMR1098 Взаимодействия Hôte-Greffon-Tumeur & Ingénierie Cellulaire et Génique, Франция

Джоузеф Исак Шапиро, Университет Маршал, САЩ
Юфен Хуанг, Университет в Юта, САЩ

† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.