Партньорско училище по физиология, фармакология и неврология, Университет в Бристол, Бристол, Великобритания

хората

Настоящ адрес: Катедра по физиология и Институт за сърдечно-съдови изследвания, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Съединени американски щати

Отделение по биохимия и Медицински институт Хауърд Хюз, Медицински факултет на Университета Станфорд, Станфорд, Съединени американски щати

Партньорство Max-Delbrück-Център за молекулярна медицина (MDC) Берлин-Бух, Берлин, Германия

Партньорско училище по физиология, фармакология и неврология, Университет в Бристол, Бристол, Великобритания

Училище по физиология, фармакология и неврология, Университет в Бристол, Бристол, Великобритания, Балтийски федерален университет, Калиниград, Руска федерация

  • Валентина Мосиенко,
  • Анди Дж. Чанг,
  • Наталия Аленина,
  • Аня Г. Тешемахер,
  • Сергей Каспаров

Фигури

Резюме

Цитат: Mosienko V, Chang AJ, Alenina N, Teschemacher AG, Kasparov S (2017) Гризачите и хората са в състояние да открият миризмата на L-лактат. PLoS ONE 12 (5): e0178478. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178478

Редактор: Йоханес Райзерт, Monell Chemical Senses Center, САЩ

Получено: 16 януари 2017 г .; Прието: 12 май 2017 г .; Публикувано: 25 май 2017 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от BBSRC: BB/L019396/1, BB/K009192/1; и MRC MR/L020661/1. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Наличието на Olfr78 в обонятелната система и неговата чувствителност към LL предполага, че гризачите и хората трябва да могат да откриват миризмата на LL. Изненадващо, това никога не е било убедително документирано. Освен това в базата данни PubChem информацията за това дали LL има мирис е противоречива, като най-скорошният запис е „без мирис“ (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/612#section=Top).

В настоящото проучване ние оценихме дали гризачите и хората всъщност са в състояние да открият миризма на LL и значението на Olfr78 при откриването на LL. Ние показваме, че мишките, плъховете и хората са в състояние да миришат на LL. Тъй като нокаутиращите мишки Olfr78 въпреки това успяха да открият LL, трябва да има повече от един LL чувствителен ИЛИ в този вид. Идентифицирането на алтернативни механизми за сигнализация на LL може да хвърли светлина върху пътищата за предаване на LL извън обонятелната система.

материали и методи

Животни

Всички процедури при мишки от див тип бяха проведени в съответствие с насоките от Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент относно защитата на животните, използвани за научни цели, а експериментите, проведени в това проучване, бяха одобрени от Сенатския комитет по етика в Берлин ( Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (LAGESO); номер на изследване G0300/13). Експериментите с плъхове са извършени съгласно Закона за животните (научни процедури) на Министерството на вътрешните работи на Обединеното кралство и одобрени от комисията за преглед на етиката на Университета в Бристол (номер на протокол 30/2875). Експериментите, проведени с помощта на мишката за нулеви/репортерски линии Olfr78, бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) в Медицинското училище в Станфордския университет (номер на протокола 19968).

Поддръжка на животни

3 и 8 мъжки мишки C57Bl/6 бяха използвани съответно за задачи по привикване-дехабитуиране и откриване на миризми. 7 хомозиготни нулеви [23] Olfr78 [23] и 9 диви мишки за контрол на отпадъци на смесен фон 129P2/OlaHsd и C57Bl/6J бяха използвани за задача за откриване на миризма. Всички мишки бяха мъжки, на възраст 5-9 месеца, настанени в група и поддържани при нормален цикъл светлина/тъмнина, със свободен достъп до храна и вода.

12 мъжки плъха с качулка Lister с тегло между 200 и 240 g (Harlan) бяха използвани в асоциативна учебна задача с награда за миризма. Всички плъхове се обработваха и претегляха ежедневно и се поддържаха в обратен 12-часов цикъл светлина-тъмнина със свободен достъп до храна и вода. 7 дни след пристигането животните са били поставени на ограничена диета в продължение на 10 дни, през които са получавали седем до девет хранителни гранули на ден, за да поддържат телесното си тегло при

85% от свободно храненото им тегло. Такъв режим на хранене се поддържа и по време на тренировъчни и тестови дни. Задачата беше изпълнена по време на тъмната фаза.

Тест за откриване на миризма при мишки

За да тестваме способността на мишките от див тип да откриват миризмата на LL, впоследствие въведохме мента (40μl прясно приготвена вода (дестилирана) екстракт от листа на мента), LL (40μl прясно приготвен разтвор в дестилирана вода, 1M, pH = 7.4, L1750 Sigma, ≥98% чистота) и урина (събрана в деня на теста от женски мишки, с които тестваните мъжки мишки никога не са били в контакт, 10 μl). Последователността на миризмите, въведена на нулеви мишки и контроли на Olfr78, беше вода (40μl), LL (80μl прясно приготвен разтвор в дестилирана вода, 2M, pH

7.4, 71718 Sigma, ≥99% чистота), урина (събрана в деня на теста от женски мишки, с които изпитваните мишки никога не са били в контакт, 10 μl), екстракт от ванилия (40 μl разтвор 1:10, разреден в дестилирана вода), дестилирана вода (40μl). 2M LL е избран за по-нататъшно тестване при нулеви мишки Olfr78 и техните кученца, тъй като 2M LL предизвиква подобни реакции на поведение при контролни мишки на смесен фон в сравнение с отговорите, предизвикани от 1M LL при мишки C57Bl6/N. 30 минути преди тестването, мъжката мишка беше поставена в нова тестова клетка и след това беше въведена миризма върху парче хартия на Ватман (2,5 см х 2,5 см) в ъгъл на клетката за 3 минути с интервал от 1 минута между различни миризми. Времето, което мишките прекарват, подушвайки въведена миризлива хартия, се измерва от наблюдател, сляп за тестваните вещества.

Тест за привикване-дехабитуация на миризми при мишки

Този тест за обоняние се използва, за да се оцени способността да се прави разлика между миризма на LL и други миризми и способността да се свиква с него. 30 минути преди тестването, мишката беше поставена в нова клетка за тестване. Всяка тестова клетка е използвана само веднъж. През следващите 10 минути в клетката беше въведена суха и чиста памучна пръчка, за да се намали неспецифичното смъркане, което не е свързано с миризмата. LL (прясно приготвен разтвор в дестилирана вода, 1M, pH = 7,4, L1750 Sigma, ≥98% чистота) впоследствие беше тестван с мента (прясно приготвен разтвор от листа от мента) и ванилия (разреден в дестилирана вода 1: 100 от екстракт от ванилия) и дестилирана вода като отрицателна контрола. Всяка миризма се въвежда три пъти в продължение на 2 минути с интервал от 1 минута между пробите върху памучна пръчка, която се потапя в разтвора на тестваното вещество. Времето, което мишките прекарват в подушване на различни миризми, се измерва от изследовател, сляп за тествани вещества.

Асоциативно обучение с миризма при плъхове

Асоциативна учебна задача с награда за миризма беше използвана, за да се установи дали плъховете са в състояние да използват миризмата на LL, за да намерят награда. Този тест е извършен съгласно [24] с модификации.

Използвана е алуминиева кутия за оперант (80cm x 80cm x 50cm). Вътрешността на кутията е боядисана със спрей в матово черно, за да се избегне наличието на визуални сигнали и да се осигури достатъчно контраст за софтуера за проследяване на движението, Biobserve (Viewer 2 версия 2.2.0.91, BIOBSERVE GmbH, Бон, Германия). Всички гъби бяха идентични, с размери 8,5 cm x 7 cm x 4 cm, с отвор от 2 cm в центъра и бяха използвани само за един ден за изпитване с отделно животно. Froot Loops на Kellogg’s, използвани в изследването, се оказаха добро подсилване в оперантни задачи [25]. Всички сесии са записани от видеокамера, разположена непосредствено над оперантната кутия, за да позволи наблюдение по време на опити и последващ офлайн анализ.

За експериментите една гъба е импрегнирана или с тестова миризма на LL (прясно приготвен разтвор в дестилирана вода, 1M, pH = 7,4, L1750 Sigma, ≥98% чистота) или контролна миризма на бадем (1: 100 разреден бадемов екстракт в дестилиран вода) непосредствено преди всяко изпитание. Бадемът е избран за положителен контрол, тъй като е известно, че плъховете могат да го помиришат и изглежда нямат предпочитания и отвращение към него [26]. Гъбата със скрито възнаграждение беше поставена в различен ъгъл на оперантната кутия за всяко изпитване в съответствие с предварително определена последователност от числа от генератор на произволни числа (1, 2 или 3). Плъхът винаги се поставяше в същия ъгъл (0) на кутията, с нос, обърнат към стената в началото на опита, а останалите два ъгъла бяха заети от празни гъби, импрегнирани с дестилирана вода. Общо 12 плъха бяха използвани за тренировка за кондициониране и всеки плъх беше тестван с двете миризми. Половината от животните първо бяха кондиционирани с бадемова миризма, а след 5-дневна почивка и с LL миризма. Другата половина бяха обусловени в обратен ред.

По време на първия тренировъчен ден на плъховете беше позволено да изследват арената в продължение на 5 минути, преди да бъде поставен един Froot Loop на пода на кутията, за да запознаят плъховете с армировката и експерименталната арена. Плъховете бяха оставени да консумират храната и след това се върнаха в домашните си клетки и процедурата се повтори (т.е. два тренировъчни епизода за всеки плъх). По време на втория тренировъчен ден беше спазен подобен протокол, с изключение на това, че в ъглите на кутията бяха поставени три (без мирис) гъби, а по време на втория опит Froot Loop беше поставен в отвора на гъба, за да се гарантира, че плъховете са успели да извлекат наградата в хода на нормалното си търсене на храна.

В деня на тестването няколко Froot Loops бяха смачкани на прах и поръсени по пода на цялата кутия, за да се предотврати ръководството на плъховете от миризмата на скритата Froot Loop по време на следващите опити. Всяка сесия се състоеше от 6 опита. Само за първото изпитване (уводно изпитване 0), наградата за храна беше поставена на върха на гъбата, така че животните да могат да я локализират визуално и това изпитване не беше включено в анализа. Това беше необходимо, тъй като в предварителните експерименти установихме, че когато смачкани Froot Loops се разпространяват около арената, плъховете по същество никога не са открили скрита награда в рамките на 5-минутен период. В следващите опити се регистрираха латентността за правилен отговор (време, необходимо на плъх за извличане на награда) и грешки. Грешките се отчитат като мушкане във вода, импрегнирана с вода, или вдишване на правилната гъба с миризма без мушкане в носа след това. Същите гъби бяха използвани за повторни опити с всеки плъх, но позицията на целевата гъба беше променена произволно след всяко проучване. След като намериха наградата за храна, на плъховете им беше позволено да я изядат, преди да бъдат извадени от кутията и върнати в домашната си клетка. Времето на прекъсване от 5 минути и 2–5 минути интервал между опитите бяха запазени.

Тест за откриване на миризма при хора

Протоколът за това проучване е одобрен от Етичния комитет на Университета в Бристол (одобрение 47121). Устното съгласие за участие в проучването беше получено от всеки участник.

За да проверим дали хората могат да открият миризма на LL, набрахме 94 млади доброволци от женски и мъжки пол (Таблица 1) и ги помолихме да посочат наличието на миризма в четири буркана, съдържащи различни химикали или вода. Тестът е извършен през три независими дни с групи от смесен пол. Редът на представяне на миризмите беше случаен и участниците не бяха информирани за това какви миризми да очакват. 100 ml 1M (pH = 7,4) прясно приготвени разтвори в дестилирана вода от LL (L7022 Sigma,

98% чистота), пируват (P2256 Sigma, ≥99% чистота), пропионат (P1880 Sigma, ≥99% чистота) или ацетат (S2889 Sigma, ≥99% чистота) бяха поставени в широки стъклени буркани без мирис, които бяха държани затворени между тестове. За контрол служи дестилираната вода. Участниците получиха въпросник, за да определят (1) дали могат да засекат някаква миризма в буркана (да/не), (2) дали възприемат тази миризма като приятна, неприятна или неутрална и (3) дали възприемат миришат като сладък, кисел/кисел, горчив, неутрален или „труден за определяне“. Участниците бяха инструктирани как да извършат теста и след това сами го изпълниха. В тестовата стая наведнъж е присъствал само един участник.

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Статистическият анализ беше извършен чрез едно- или двупосочен ANOVA или повторни измервания ANOVA с корекция на Bonferroni като post-hoc тест за множество сравнения, t-тест или точен тест на Fisher, изчислен от непредвидена таблица (PRISM, GraphPad, Сан Диего, Калифорния). За да се анализира обучение, свързано с възнаграждение, при плъхове всички данни за грешките се трансформират в правилни/неправилни биномни данни и се оценяват чрез анализ на непредвидени обстоятелства, за да се сравнят разпределенията (или хи-квадрат тест за тенденция, или хи-квадрат тест за добро състояние). Р 0,05, Фигура 1А). Мишките прекараха 11 пъти по-дълго подушване на хартия, съдържаща урина в сравнение с вода (урина 52,12 ± 3,85 сек срещу вода 4,84 ± 0,64 сек, р Фиг. 1. Мишките са в състояние да открият и различат миризмата на L-лактат.

А. Задача за откриване на миризма. Мишките прекарваха значително повече време, подушайки L-лактат (1M), отколкото вода, и същото количество време като екстракта от мента. Данните са показани като средно ± SEM, n = 8. * p # p 0,05, фигура 2В). Следващите опити (2–5) разкриха ефекта от номера на изпитването върху латентността за намиране на наградата по миризма (F (4,44) = 4,610, P 0,05, фигура 2B). По време на последното изпитване (5), плъховете намериха наградата много по-бързо, отколкото в началото (опит 1 срещу опит 5, p 0,05, фигура 2C), а вероятността за правилен избор беше по-висока от това, което може да се очаква случайно (p Фигура 2. Плъховете са способни да различават миризмата на L-лактат.

А. Схематична илюстрация на асоциативна учебна задача с награда за миризма при плъхове. По време на тренировъчните дни плъховете бяха привикнали към арената и процедурата за извличане на награди. По време на въвеждащото изпитване (0) в деня на теста (не е включен в по-нататъшен анализ), гъба, напоена с тестовия одорант, носи видима награда за храна. По време на последвалите пет опита в деня на тестване, произволно поставена гъба, напоена с тестовата миризма, раздава скрита награда. Резултати от задачата за асоцииране на миризмите при плъхове: B. Времето, необходимо на плъховете за намиране на хранителна награда по миризмата (латентност), не се различава между L-лактат и положителна контрола, бадем. По време на изпитанията латентността за намиране на награда за храна намалява и за двете миризми. Данните са показани като средно ± SEM, n = 12. * p ### p ## p Фиг. 3. Зависими от пола разлики в възприемането на миризмата на L-лактат от хората.