Редактиран от Робърт Дж. Казинс, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида (получено за преглед на 18 март 2005 г.)

води

Резюме

За да се изясни коя от тези три метаболитни аномалии е патофизиологичната основа за рахит, бяха проведени проучвания в два допълнителни миши модела: мишки с хипофосфатемия, вторични при мутации в гена Phex (Hyp мишка) (3), свързани с нормален калций и паратиреоиден хормон ( PTH) нива; и мишки с индуцирана от диетата хипофосфатемия/хиперкалциемия, при която нивата на PTH са потиснати. Тези проучвания показват, че нарушената апоптоза на крайните хипертрофични хондроцити, вторични за хипофосфатемията, е общият медиатор на рахита в трите изследвани модела. In vitro анализи в първични миши хондроцити показват, че фосфатът медиира хипертрофична апоптоза на хондроцитите чрез активиране на каспаза-9-зависимия митохондриален път. Проучвания при мишки, лекувани с инхибитор на каспаза-9, потвърждават критичното значение на митохондриалния път за съзряване на растежната плоча in vivo.

Материали и методи

Животни. Всички проведени проучвания са одобрени от институционалната комисия за грижи за животните. Мишките бяха поддържани в съоръжение без вирус и паразити без бариери и бяха изложени на 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Всички мишки в това проучване имат C57BL/6J фон. Мишките са отбити на 18-дневна възраст със стандартна диета, съдържаща 1% калций, 0% лактоза и 0,44% фосфор. За да се нормализират нивата на минералните йони в кръвта на VDR-нокаутиращите мишки, животните са хранени с γ-облъчена тестова диета (TD96348, Teklad, Madison, WI), съдържаща 2% калций, 1,25% фосфор и 20% лактоза от 18 дни на възраст. За да се предизвика хипофосфатемия/хиперкалциемия при мишки от див тип, животните се отбиват на 18-дневна възраст на диета (TD98103, Teklad), съдържаща 2% калций, 20% лактоза и 0,02% фосфор. За да се оцени зависимата от каспаза апоптоза in vivo, инхабитор на каспаза-3 (Z-DEVD-FMK) или инхибитор на каспаза-9 (Z-LEHD-FMK) (Calbiochem) се инжектира ежедневно (4 nmol/g телесно тегло) i.p. от 18 до 23-дневна възраст в мишки C57BL/6J, хранени с редовна диета.

Биохимични параметри. Нивата на серумен фосфат се измерват с помощта на комплекта Phosphorus Liqui-UV (Stanbio Laboratory, Boerne, TX). Нивата на серумния калций се измерват с помощта на тестовия комплект за калциев CPC LiquiColor (лаборатория Stanbio). Нивата на PTH в серума се определят чрез използване на непокътнат PTH ELISA комплект на мишка (Immutopics, San Clemente, CA).

Хистология на тъканите. Пищялите се фиксират и декалцифицират в 10% формалин-PBS/20% EDTA (рН 8.0) за 24-48 часа. След това пробите бяха обработени, вградени в парафин и разделени с Microtome (RM 2025, Leica, Deerfield, IL). За да се оцени минерализацията, недекалцифицираните секции бяха вградени в метилметакрилат преди секционирането.

Оценка на апоптозата. Апоптотичните клетки бяха идентифицирани с помощта на TUNEL-базиран in situ комплект за откриване на клетъчна смърт (Roche Diagnostics). След третиране с 10 μg/ml протеиназа К в продължение на 30 минути при 37 ° C, срезовете бяха инкубирани с реакционната смес TUNEL в продължение на 2 часа при 37 ° C, изплакнати, оцветени с 2% разтвор на Evans blue (Sigma) и монтирани с Vectashield (Векторни лаборатории).

Имунохистохимия. Имунохистохимията с използване на антитяло към разцепена каспаза-3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) (9) и TSA комплект за биотин система (PerkinElmer) беше извършена, както се препоръчва от производителя. Имунореактивните протеини се визуализират чрез използване на стрептавидин-алкална фосфатаза (PerkinElmer), последвано от инкубация с субстрат от червена алкална фосфатаза Vector (Vector Laboratories).

Първични хондроцитни култури. Костохондралната област на ембрионалния ден 18.5 ембриони се дисектира и прехвърля в PBS. Хондроцитите се изолират чрез разграждане на колагеназа (10) и се посяват при плътност 3 × 105 клетки на гнездо в 0,1% покрити с желатин шест ямки (Becton Dickinson). Клетките се култивират в DMEM/10% FBS, съдържащ 25 μg/ml 1-аскорбинова киселина. За да се оцени активирането на апоптотичните пътища, клетките се третират с фосфат (NaH2PO4) при концентрации, вариращи от 1 тМ до 7 тМ в продължение на 18 часа. Контролните култури се третират със 7 mM Cl - (NaCl). За да се блокира преходът на митохондриалната пропускливост, който участва в освобождаването на активиращи каспаза молекули и последваща метаболитна недостатъчност в митохондриите (11), клетките бяха третирани с 1 μM циклоспорин А (Sigma) (12).

Анализ на Western Blot. Първичните хипертрофични хондроцити бяха лизирани в Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2% Triton X-100, 0.1% SDS и протеазна инхибиторна смес (Roche Diagnostics). Десет микрограма протеин се подлагат на SDS/PAGE при редуциращи условия. Имунодетекцията се извършва с анти-каспаза-9 (клетъчна сигнална технология). Имунореактивните протеини се визуализират чрез използване на комплект за откриване на хемилуминесценция (NEN) в съответствие с инструкциите на производителя.

Хистологичен анализ и оценка на хипертрофична апоптоза на хондроцити при 24-дневни мишки. Показани са оцветени с хематоксилин/еозин участъци (A и C) и TUNEL анализ (B и D). (A и B) Мишки от див тип (WT) и VDR с нокаут (KO) се хранят с обикновена диета (вляво) или спасителна диета (вдясно), която нормализира хомеостазата на минералните йони. (C и D) Мишки от див тип, хранени с редовна диета, Hyp мишки, хранени с редовна диета, а мишки от див тип, хранени с диета с високо съдържание на калций/ниско съдържание на фосфати от 18 до 24-дневна възраст. Скобите показват хипертрофичния хондроцитен слой. Данните са представителни за експериментите, проведени върху участъци от три или повече мишки за всяко състояние. EV, синьо Evans; Т, ТУНЕЛ.

Хистологичният анализ на растежната плоча на 24-дневните мишки Hyp, животински модел за Х-свързана хипофосфатемия на човешкото разстройство, разкрива значително разширяване на хипертрофичния хондроцитен слой (фиг. 1С). Тези рахитични промени също са свързани със значително намаляване на броя на TUNEL-позитивните късни хипертрофични хондроцити, в сравнение с тези на техните диви тип котила (фиг. 1D). Тъй като генът Phex се експресира в растежната плоча, патофизиологията на тези рахитни промени може да бъде многофакторна, следователно беше изследван втори модел, за да се установи дали хипофосфатемията сама по себе си води до развитие на рахит. Мишките от див тип C57BL/6J бяха отбити на фосфорно ограничена/висококалциева диета от 18 до 24-дневна възраст. Разширяване на късния хипертрофичен хондроцитен слой се наблюдава при тези мишки от див тип (фиг. 1С), свързано с значително намаляване на броя на TUNEL-положителните хипертрофични хондроцити, в сравнение с мишки от див тип, хранени с редовна диета (фиг. 1D) . Тези данни показват, че и при трите рахитични модела разширяването на растежната плоча е свързано с нарушена апоптоза на късните хипертрофични хондроцити.

Общият метаболитен параметър, който обединява тези рахитични модели, е хипофосфатемия (фиг. 2А): мишките Hyp са имали нормални нива на калций (фиг. 2Б) и PTH (фиг. 2С) на 24-ия ден, докато мишките са хранели ниско фосфорно/високо -калциевата диета е хиперкалциемична с потиснати нива на ПТХ. Както беше съобщено по-рано, в третия рахитичен модел, който се изследва, VDR-нулеви мишки, хранени с редовна диета, са били хипофосфатемични с повишени нива на PTH на 24-ия ден (8).

Биохимични параметри. Серумният фосфат (A), серумният калций (B) и имунореактивният PTH (C) са измерени при 24-дневни мишки от див тип, хранени с редовна диета (черни ленти), Hyp мишки, хранени с редовна диета (бели ленти), и мишки от див тип, хранени с диета с високо съдържание на калций/ниско съдържание на фосфати (сиви ленти). (D) Серумни нива на фосфат на 18,5 дни след покоит и на 0,5, 10 и 24-дневна възраст при диви (♦) и Hyp (○) мишки, хранени с редовна диета. Данните представляват средната стойност ± SD на стойности от пет мишки за всеки анализ. *, P ≤ 0,05.

Хистологичен анализ и оценка на хипертрофична апоптоза на хондроцити при мишки Hyp. Оцветяването с хематоксилин/еозин (A и C) и TUNEL анализи (B и D) бяха проведени на участъци от мишки от див тип (WT) и Hyp на 0,5 ден (A и B) и 10-дневна възраст (C и D). Скобите показват хипертрофичния хондроцитен слой. Данните са представителни за експериментите, проведени върху участъци от три или повече мишки за всяко състояние. EV, синьо Evans; Т, ТУНЕЛ.

Минерализация на растежни плочи при 24-дневни мишки. оцветяването на фон Коса се извършва на участъци от 24-дневни мишки от див тип, хранени с редовна диета, мишки Hyp, хранени с редовна диета, и мишки от див тип, хранени с диета с високо съдържание на калций/ниско съдържание на фосфати от 18 до 24 дни възраст. Вложките показват увеличение на хипертрофичните хондроцити. Скобите показват хипертрофичния слой на хондроцитите. Данните са представителни за участъци от пет мишки за всяко състояние.

Доказано е, че фосфатните йони индуцират апоптоза на птичи хондроцити в културни модели (15). За да се демонстрира, че активирането на каспаза участва в късната хипертрофична апоптоза на хондроцитите in vivo, беше проведена имунохистохимия за оценка на активирането на каспаза-3 в рахитни и нормални растежни плочи. Процентът на късните хипертрофични хондроцити, проявяващи разцепена имунореактивност на каспаза-3, значително намалява както при мишките Hyp (10,4 ± 1,1%), така и при мишките с индуцирана от диетата хипофосфатемия (12,5 ± 1,2%) на 24-дневна възраст, в сравнение с тази на техните диви тип котила (54,2 ± 3,6%) (фиг. 5). Тъй като активирането на каспаза-3 е общ терминален маркер на мембранните и митохондриалните апоптотични пътища (16), първичните хондроцитни култури са използвани за дисекция кой от тези пътища медиира ефектите на фосфатните йони върху апоптозата на хондроцитите.

Разцепена каспаза-3 имунохистохимия. Секции от 24-дневни мишки от див тип (WT), хранени с редовна диета, мишки Hyp, хранени с редовна диета, и мишки, хранени с диета с високо съдържание на калций/ниско съдържание на фосфати от 18 до 24-дневна възраст, бяха имунооцветени с антитела към разцепена каспаза-3. Скобите показват хипертрофичния хондроцитен слой. Данните са представителни за експериментите, проведени върху участъци от три или повече мишки за всяко състояние.

Фосфатът индуцира хипертрофична апоптоза на хондроцитите in vitro. Хипертрофичните хондроцити се третират със 7 mM NaCl или 7 mM NaH2PO4 в продължение на 18 h в присъствието или отсъствието на 1 μM циклоспорин А (CsA). Клетъчните лизати се подлагат на Western blot анализ, използвайки анти-каспаза-9. Аналогично бяха анализирани лизати на 3T3 фибробласти и пролифериращи хондроцити (PC), третирани със 7 mM NaH2PO4. Данните са представителни за тези, получени от три независими клетъчни препарата.

In vivo инхибирането на каспаза-3 или каспаза-9 води до разширяване на хипертрофичния хондроцитен слой. Показани са оцветени с хематоксилин/еозин участъци от 24-дневни мишки, инжектирани на 18-23 дни с DMSO, инхибитор на каспаза-3 (Z-DEVD-FMK) или инхибитор на каспаза-9 (Z-LEHD-FMK). Скобите показват хипертрофичния хондроцитен слой.

Дискусия

Проучванията in vitro включват фосфат като модулатор на апоптозата на хондроцитите. Неорганичният фосфат индуцира апоптоза на хондроцитите в зависимост от дозата и времето (30). Нашето проучване разширява тези наблюдения, демонстрирайки ефекта на фосфата върху апоптозата на хондроцитите in vivo. Нашите проучвания посочват циркулиращия фосфат, а не локално депонираният фосфат, като ключов детерминант на хипертрофичната апоптоза на хондроцитите, тъй като се наблюдава нарушена апоптоза, когато все още има забележимо оцветяване на фон Коса (което показва минерализация) на късния хипертрофичен хондроцитен слой. Изследвания в тъканната неспецифична алкална фосфатаза (TNAP) нокаут мишка, модел за хипофосфатазия на човешкото разстройство, подкрепят тази хипотеза (31). Липсата на алкална фосфатаза уврежда отлагането на минерали, поради което въпреки нормалните нива на циркулиращи минерални йони, нулевите TNAP мишки имат намалена минерализация на скелета. Вместо разширена плоча за растеж, при тези мишки се наблюдава спиране на развитието на диференциацията на хондроцитите. Налице е значително намаляване на хипертрофичния слой на хондроцитите, въпреки виртуалната липса на минерализация в този регион.

Взети заедно, моделите, използвани в настоящите разследвания, подкрепят хипотезата, че циркулиращият фосфат е ключов определящ фактор за хипертрофична апоптоза на хондроцитите in vivo. Паралелни проучвания в in vitro културен модел предполагат, че фосфатът действа директно върху хипертрофичните хондроцити, а не регулира производството на паракринни и/или ендокринни фактори, които от своя страна насърчават апоптозата на тези клетки. Идентифицирането на специфичен фосфатен сензор или транспортер, изразен в хипертрофични хондроцити, който е отговорен за тези ефекти, е критична следваща стъпка. Характеризирането на този транспортер ще идентифицира основата за постулирания праг в циркулиращия фосфат, под който се наблюдава нарушена апоптоза, както и ще играе критична роля при идентифицирането на потенциални терапевтични агенти за лечение на рахитични разстройства.

Благодарности

Благодарим на Паола Дивиети за нейните проницателни коментари. Тази работа беше подкрепена от Национален здравен институт за безвъзмездна помощ DK46974 (на M.B.D.) и Йейлския основен център за мускулно-скелетни заболявания. Y.S. е получател на стипендия от канадските институти за здравни изследвания.

Бележки под линия

↵ ‡ До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: demayhelix.mgh.harvard.edu .

Принос на автора: Y.S. и M.B.D. проектирани изследвания; Y.S., T.O.C. и M.B.D. извършени изследвания; T.O.C. и M.B.D. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; Y.S. и M.B.D. анализирани данни; и Y.S., T.O.C. и M.B.D. написа вестника.

Този документ беше изпратен директно (Track II) в офиса на PNAS.

Съкращения: 1,25 (OH) 2D, 1,25-дихидроксивитамин D; VDR, витамин D рецептор; PTH, паратиреоиден хормон.