Affiliations School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Великобритания, School of Life Sciences, University of Nottingham Medical School, Queen’s Medical Center, Nottingham, United Kingdom

хамстер

Affiliation School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Великобритания

Affiliation School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Великобритания

Отдел за биомедицински науки, Университет в Каляри, 09042 Монсерато, Каляри, Италия

Отдел за биомедицински науки, Университет в Каляри, 09042 Монсерато, Каляри, Италия

Отдел за биомедицински науки, Университет в Каляри, 09042 Монсерато, Каляри, Италия

Affiliation Rowett Institute for Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

Affiliation School of Life Sciences, University of Nottingham Medical School, Queen’s Medical Center, Nottingham, United Kingdom

Affiliation School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Великобритания

  • Джо Е. Луис,
  • Джон М. Брамелд,
  • Фил Хил,
  • Кристина Коко,
  • Барбара Ноли,
  • Джан-Лука Фери,
  • Пери Барет,
  • Франсис Дж. П. Еблинг,
  • Preeti H. Jethwa

Корекция

28 юли 2017 г .: Lewis JE, Brameld JM, Hill P, Cocco C, Noli B, et al. (2017) Корекция: Хипоталамичната свръхекспресия на VGF в сибирския хамстер увеличава енергийните разходи и намалява наддаването на телесно тегло. PLOS ONE 12 (7): e0182594. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182594 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Цитат: Lewis JE, Brameld JM, Hill P, Cocco C, Noli B, Ferri G-L, et al. (2017) Хипоталамусната свръхекспресия на VGF в сибирския хамстер увеличава енергийните разходи и намалява наддаването на телесно тегло. PLoS ONE 12 (2): e0172724. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0172724

Редактор: Alessandro Bartolomucci, Университет на Минесота, градове-близнаци, САЩ

Получено: 8 декември 2016 г .; Прието: 8 февруари 2017 г .; Публикувано: 24 февруари 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Работата беше подкрепена от наградата за трансфер на знания от Университета в Нотингам и наградата за стратегически умения на BBSRC. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

VGF е индуциран от невротрофин ген, който е широко експресиран в невронални и невроендокринни клетки. Генът VGF кодира 68kDa полипептид, който се разцепва от прохормонови конвертази (PC) в множество по-малки пептиди и се освобождава при деполяризиращи стимули [1–4]. Докато VGF иРНК се експресира в много региони на нервната система, най-високите концентрации на VGF имунореактивност се откриват във вентромедиалния хипоталамус, по-специално дъгообразното ядро ​​(Arc) и паравентрикуларното ядро ​​(PVN) [5–7].

За първи път беше подчертано, че VGF има роля в енергийната хомеостаза чрез експерименти, включващи диетични манипулации при мишки. На гладно се увеличи VGF иРНК в дъгата и нивата впоследствие бяха намалени при повторно хранене [8]. Тази анаболна роля за VGF беше подкрепена от наблюдения в VGF нулева (VGF -/-) мишка [8]. VGF -/- мишките са малки, слаби, хиперметаболитни и хиперактивни. Те консумират повече храна на грам телесно тегло, отколкото контролите от дивия тип, и показват повишена консумация на кислород и двигателна активност [8]. Интересното е, че аблация на гена VGF блокира развитието на затлъстяване при диетични и злато-тиоглюкозни мишки и VGF -/- мишки, кръстосани с (A y/a) (agouti) мишка, докато наддаването на тегло се отслабва в ob/ob мишка [9, 10].

Следователно целта на това проучване беше да се разбере по-добре ролята на VGF в регулацията на енергийната хомеостаза чрез използване на рекомбинантен аденоасоцииран вирусен вектор (AAV) за свръхекспресия на VGF в хипоталамуса на възрастни мъжки сибирски хамстери, като по този начин се избягва развитието ефекти или свързана функционална компенсация. По-рано демонстрирахме възможността за използване на вирусна 2A последователност в комбинация с AAV за дългосрочното свръхекспресия на гени VGF и флуоресцентен репортер (eGFP) в хипоталамуса на сибирския хамстер [16].

Методи

Животни

Мъжки сибирски хамстери (Phodopus sungorus) на възраст 3 месеца са отведени от колония, поддържана от Университета в Нотингам (Ebling, 1994). Хамстерите са настанени в отделни клетки при контролирана температура (21 ± 1 ° C) и на обратен фотопериод от 16 часа светлина/8 часа тъмно (светлините се изключват в 11:00 часа), с ad-libitum достъп до храна и вода, освен ако не е посочено друго. Диетата беше стандартна лабораторна чау, състояща се от 19% екструдиран протеин и 9% мазнини (Teklad 2019, Harlan, UK). Всички процедури за животни са одобрени от Съвета за хуманно отношение към животните и етичен преглед на Университета в Нотингам и са извършени в съответствие с Закона за животните във Великобритания (научни процедури) от 1986 г. (лиценз за проект PPL 40/3604).

Синтез на конструкт и вирусни частици

Синтезът на конструкции и вирусни частици, включително in vitro и in vivo валидиране, е описан по-рано [16]. Накратко, pAAV-CBA-VGF-2A-eGFP (впоследствие наречен pAAV-VGF-GFP) е конструиран чрез премахване на AgRP-IRES-eGFP от плазмида pAAV-CBA-AgRP-IRES-eGFP-WPRE (един вид подарък от Д-р Мигел Сена-Естевес (Университет на Масачузетс, Уорчестър, САЩ; [17]) и вмъкване на VGF-2A-eGFP. След това плазмидът беше секвениран, за да потвърди премахването на AgRP-IRES-eGFP и вмъкването на VGF-2A-eGFP в правилна ориентация. След валидиране in vitro в клетъчната линия на невробластома SH-SY5Y, плазмидът pAAV-VGF-GFP е пакетиран в AAV-2 от Vector BioLabs (PA, САЩ) и пакетираният AAV-GFP контрол е закупен от Vector Biolabs ( PA, САЩ).

Вливане на вирусни конструкции

Метаболитни газове и поведение при хранене

Ефект на свръхекспресията на VGF в хипоталамуса на сибирски хамстери

Количествено определяне на пептидите

Количественото определяне на VGF пептидите, включително TLQP, AQEE и NERP-2, се извършва чрез ELISA върху цели хипоталамусни проби. Антителата, използвани при всеки анализ, са произведени срещу следните пептиди: N-терминалният декапептид на TLQP-21 (плъх VGF556-565), AQEE-30 (плъх VGF586-595) и С-крайният неапептид на NERP-2 ( плъх VGF342-350), който съдържа амидна група в своя С-край, конюгиран с говежди тиреоглобулин или хемоцианин на отвора на отвора чрез допълнителен цистеин в С-края (TLQP, AQEE) или N-край (NERP-2). Всяко антитяло има висок афинитет към съответния VGF пептид, но други разцепени пептиди, обхващащи последователността, също могат да бъдат разпознати, както беше наблюдавано по-рано с TLQP антисерум, който се свързва с TLQP-21, но също и с TLQP-62 [15]. ELISA се извършва, както е описано по-горе [15]. Накратко, плаки с много ямки, покрити със специфичните синтетични VGF пептиди, бяха инкубирани с VGF антисерумите паралелно с тъканни проби и стандарти (същите синтетични пептиди, използвани за имунизации), последвани от съответните биотинилирани вторични антитела (Jackson, West Grove, PA, САЩ) и конюгата на стрептавидин-пероксидаза (Biospa, Милано, Италия). Всеки VGF анализ се характеризира с използване на различни синтетични пептиди (виж Таблица 1).