Резюме

Въведение

Понастоящем затлъстяването се разглежда широко като хронично невроендокринно заболяване, като основната аномалия е в централната регулация на апетита. Медиобазалният хипоталамус (MBH) интегрира периферни анорексигенни и орексигенични сигнали, за да определи нетно чувство за ситост или глад (1). През последните десетилетия бяха предоставени убедителни доказателства, че лептинът, отделен от мастната тъкан, е един от основните анорексигенни сигнали от периферията в мозъка и че лептиновата резистентност в MBH е често срещана патология при затлъстяване при гризачи и хора (2). Докато резистентността към лептин е силно свързана с често срещаните единични нуклеотидни полиморфизми (SNP), например в рецептора за меланокортин 4 (MC4R) (3), общоприето е, че генетичните фактори могат да обяснят само част от епидемията от затлъстяване.

хипоталамусното

Нискостепенното възпаление, свързано със затлъстяването, първоначално е описано в мастната тъкан (4–6). През 2005 г. беше публикувано първото проучване, което предполага, че възпалението може да възникне и в хипоталамуса на затлъстелите животни (7). В това проучване на индекса дългосрочното хранене на плъхове с диета с високо съдържание на мазнини предизвиква възпаление на MBH и това предизвиква резистентност към хипоталамусния лептин, свързано с развитието на затлъстяване (7). Хистологично възпалението на хипоталамуса (HI) се характеризира с глиоза, която включва инфилтрация на микроглия и пролиферация на астроцити, което води до повишена клетъчна плътност (8). При животински модели възпалението и глиозата на MBH се откриват дори преди наддаване на телесно тегло, което предполага, че HI наистина може да бъде причинител в патофизиологията на затлъстяването (9).

Докато констатациите за HI и глиоза са потвърдени от няколко независими групи в модели на животни с гризачи и нечовешки примати (8–10), данните за HI при хора все още са редки. През 2012 г. ретроспективен анализ на ядрено-магнитен резонанс на мозъка от 34 човешки субекти с ИТМ в диапазона от 17,7 до 44,1 kg/m 2 разкрива свръхинтензивност в Т2-претеглена ЯМР на MBH при затлъстели хора, което е значително свързано с BMI Освен това през изминалата година беше публикувано проспективно проучване, което също използва ЯМР при 67 участници (11). Установено е, че по-дългото време за релаксация на Т2 е свързано с по-висок ИТМ и е по-забележимо в лявата MBH, като дясната MBH показва по-дълги времена на T2 релаксация само при субекти с най-висок интензитет на сигнала вляво. Важно е, че в това неотдавнашно проучване Елън Шур и нейните колеги също извършиха MRI сканиране на мозъчни резени след смъртта и свързаха своите MRI данни с хистологично оцветяване за глиален фибриларен киселинен протеин. Използвайки този подход, те убедително потвърдиха, че ЯМР наистина открива HI и глиоза, потвърждавайки, че тази техника е надежден метод за откриване на сурогатни маркери на възпаление на MBH при изследвания върху хора.

В настоящото проучване изследвахме лица, страдащи от затлъстяване и затлъстяване, чрез комбиниране на мозъчен ЯМР, подробен хранителен анализ, секвениране на микробиоми на 16S рДНК и генотипиране въз основа на масив, за да получим по-нататъшна представа за HI при човешкото затлъстяване.

Изследователски дизайн и методи

ЯМР и спектроскопия

ЯМР изследванията са извършени на 3T MRI скенер (Achieva; Phillips Medical Systems, Айндховен, Холандия) с 32-канална главна намотка. Данните от спектроскопията бяха анализирани с помощта на пакета Philips SpectroView. За анализа на метаболитите N-ацетиласпартат (NAA) е сравнен с креатин (Cr) (12,13).

Бактериално 16S рРНК генно секвениране, контрол на качеството и анализ на биоинформатиката бяха извършени, както е описано по-рано (14).

Генотипиране въз основа на масив

Пробите FoCus (Food Chain Plus) бяха набрани в масива OmniExpress Exome. Данните за генотипирането са подложени на строг контрол на качеството (15), оставяйки 1751 проби с 964 193 често срещани и редки SNP.

Колекция от тъкани

Хипоталами на двама субекти бяха дисектирани при аутопсия, фиксирани чрез потапяне в неутрално буфериран 10% формалин, дехидратирани и вградени в парафин. Серийните коронални мозъчни участъци бяха изрязани от нивото на оптичната хиазма до каудалната граница на телата на бозайниците. Последователни 4-μm участъци от хипоталамус (преоптични, супраоптични, туберални и млечни хипоталамусни области) бяха депарафинизирани и рехидратирани в градуирани алкохоли.

Имунохистохимични оцветявания и фотомикрография

Срезите на човешката постмортна хипоталамусна тъкан се подлагат на стандартна процедура за извличане на топлинен антиген на основата на цитрат, промиват се три пъти в PBS и се блокират с 0.75% BSA в PBS за 45 минути. Впоследствие секциите бяха инкубирани с първичните антитела (антиглиален фибриларен киселинен протеин [αGFAP], заешки моноклонални или анти-IBA1, заешки моноклонални [Abcam]) при разреждане 1: 500/1: 250 в 0.75% BSA при 4 ° С през нощта, съответно. След подходящи етапи на измиване в PBS, антитяло, свързано с тъкан, беше открито, използвайки биотинилирани кози анти-заешки IgG антитела (Vector Laboratories), последвано от конюгиран авидин, конюгиран с пероксидаза от хрян, и двата разредени при 1: 200 в PBS. При пропуснати първични антитела като контролни бяха използвани само вторични антитела и/или конюгиран авидин, конюгиран с пероксидаза от хрян. За откриване на сигнала са използвани стандартни хромогенни техники (Vector Laboratories).

Статистически анализ

Статистически анализи и графики бяха извършени с помощта на R (16). За проверка на нормалното разпределение на данните бяха използвани тестовете на Shapiro-Wilk и методите за визуализация. За групови сравнения бяха използвани двустранен t тест или тест за ранг на Wilcoxon. Отклоненията бяха идентифицирани визуално. Освен ако не е посочено друго, P стойности 5%, ние получихме за MC4R n = 1 SNP, за JNK n = 6 SNP, за NF-ĸB n = 13 SNP и за FTO n = 137 SNP.

Микробиомен анализ

Всеки род (данни за преброяване) на измеримия микробиом от n = 26 рода е индивидуално корелиран със съотношението на сигнала MBH/амигдала на затлъстелата човешка група (n = 48), докато P стойностите са изчислени с помощта на алгоритъм AS_89 (18). Всички корелации бяха извършени с помощта на теста за корелация на Spearman rank поради непараметрично разпределение на данните.

MRS анализ на данните

Ние разгледахме различни възможни форми на нелинейни връзки между съотношението на сигналите NAA/Cr (L) и MBH/амигдала (L) (както в пълната извадка, така и поотделно за субекти със затлъстяване и небъдещи), по-специално прагови ефекти и експоненциални и U- или S -формени взаимоотношения. След като потвърдихме чрез визуална проверка на разпръснати парцели, че няма такива връзки, ние използвахме трансформирани в ранг стойности на NAA/Cr (L) като зависима променлива в линеен модел, който би открил всяка монотонна (също нелинейна) връзка между NAA/Cr ( L) и съотношение на сигнала MBH/амигдала (L).

Етика

Изследването е одобрено от местната комисия по етика в Кил, Германия (A156/03-4/13) и всеки пробанд е дал информирано съгласие преди включването му в проучването.

Резултати

HI и глиозата присъстват в човешкото затлъстяване и са ограничени до левия хипоталамус

В настоящото проучване ние изследвахме MBH на 57 човешки субекти със затлъстяване и 54 контролни субекта, честота, съчетана по възраст и пол, чрез Т2-претеглено MR изображение. Техните характеристики са дадени в Таблица 1. Както предлага Джошуа Талер и колеги (9), в настоящото изследване на ЯМР свързваме интензивността на MBH T2 с интензивността на амигдалата на корпусите, за да се нормализира за неспецифични невронални ефекти (Фиг. 1) . Както е показано на фиг. 2А, затлъстелите хора показват значително увеличение на интензивността на MBH T2, което показва възпаление и глиоза, ефект, който се открива само в левия, а не в десния хипоталамус. Освен това беше извършен анализ на чувствителността, като бяха изключени шест лица с наднормено тегло от сравнението на интензивността на MRT T2 (R) между лица, страдащи от затлъстяване и затлъстяване, което не доведе до значителна промяна в статистическия резултат (P = 0.54). Освен тези констатации при затлъстяване, заслужава да се спомене, че при неносебни контролни субекти установихме, че интензивността на MBH T2 е физиологично по-ниска в ляво в сравнение с дясното MBH (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Обобщение на характеристиките на предмета

HI и глиозата при затлъстяването при хора са свързани със системно нискостепенно възпаление, но не с периферна инсулинова чувствителност или хипертриглицеридемия

След това имаме за цел да разгледаме дали HI и глиозата са свързани със системно нискостепенно възпаление или с периферни метаболитни нарушения, например инсулинова резистентност и/или хипертриглицеридемия. Затова измерихме серумни нива на IL-6 и нива на CRP като системни възпалителни маркери и глюкоза и инсулин (изчисляване на HOMA-IR), както и нива на триглицериди като метаболитни параметри. Корелационните анализи разкриват положителна корелация на IL-6 и CRP с отношението на сигнала MBH/амигдала (L), докато метаболитните фактори не показват връзка (IL-6: P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Линеен модел на съотношение на сигнала MBH/амигдала (L)

HI и глиозата при човешкото затлъстяване не са свързани с намален брой невронални клетки

След като установихме, че HI и глиоза присъстват в левия MBH на затлъстели хора, ние по-нататък си поставихме за цел да изследваме дали възпалителната реакция е свързана с разрушаване на невроните, което би предполагало необратимост на процеса. Използвайки MRS, ние оценихме броя на невроналните клетки, като изчислихме съотношението NAA/Cr в лявото полукълбо. Сравнението на съотношението NAA/Cr на неносените спрямо затлъстелите хора не показа значима разлика, което предполага липса на намаляване на броя на невроналните клетки в левия хипоталамусен регион (Фиг. 3). Също така не е установена значителна разлика в съотношението NAA/Cr, когато са изследвани индивиди с и без Т2 хиперинтензивност (P = 0,54 чрез тест на Wilcoxon). В допълнение беше приложен линеен модел за коригиране на затлъстяването, което отново предполага липсата на невронална деструкция в левия хипоталамусен регион.

Подобен брой невронални клетки сред двете групи тегло. NAA (маркер за невронална и аксонална жизнеспособност и интензивност) е сравнен с Cr (вътрешна референция). Пациентите с нонобеза (n = 38) и затлъстяване (n = 43) бяха сравнени по отношение на съотношението на сигналите им за ляв MBH NAA/Cr (тест за ранг на Wilcoxon), не показващи значителни разлики в броя на невроналните клетки (P = 0,12). Тридесет и един субекта бяха изключени от анализа на данните за MRS, тъй като пиковете на метаболитите не можеха да бъдат определени правилно или защото равнината на MRS пропусна хипоталамуса. n.s., без значение.

HI и глиозата при затлъстяване са свързани с нарушения в чревния микробиом

След това изследвахме дали MBH възпалението и глиозата са свързани със специфични чревни микроорганизми. Фекални проби от затлъстели хора са били подложени на 16S rDNA секвениране и е анализиран основният измерим микробиом, включително n = 26 рода. Корелационните анализи в групата на затлъстелите хора идентифицират две бактерии, показващи номинално значима, отрицателна корелация със съотношението на сигнала MBH/амигдала (L): Parasutterella sp. и Marinilabiliaceae (род некласифициран) (Таблица 3). Допълнителен корелационен анализ на основните измерими видове микробиоми в рода Parasutterella sp. последвано от взрив на нуклеотидна последователност (19) идентифицира P. excrementihominis, че е отрицателно свързан със съотношението на сигнала MBH/амигдала (L) при затлъстели хора. Нито една от изследваните чревни бактерии не показва значителна положителна връзка със съотношението на сигнала MBH/амигдала (L).

Корелационни анализи на две идентифицирани бактерии с отношение на сигнала MBH/амигдала (L) и хранителни параметри

Нарушенията на чревната микробиота, свързани с възпаление и глиоза на MBH, са свързани с хранителните мазнини, но не и с въглехидратите, протеините или общия енергиен прием

Честите полиморфизми в гена JNK или в гена MC4R увеличават индивидуалната чувствителност към HI и глиоза

Графични кутии, показващи SNP в рамките на кандидат-гени като значително свързани с хиперинтензивността на MBH T2 при пациенти със затлъстяване. Носенето на хетерозиготен SNP на гена JNK (SNP rs1062225) или гена MC4R (SNP rs11872992) е свързано с повишени нива на HI в групата на пациентите със затлъстяване (тест за ранг на Wilcoxon). Един пробанд с хомозиготна мутация за MC4R беше изключен от анализа на MC4R. За SNP в гена JNK не съществуват пробанди с хомозиготни мутации.

Загуба на тегло и подобряване на периферната чувствителност към инсулин поради бариатрична хирургия не засягат HI или глиоза

В подгрупа (n = 10) от затлъстелите индивиди от настоящото проучване, ние също изследвахме възпалението и глиозата на MBH в отговор на бариатрична хирургия. Както е показано на фиг. 5А и В, за период от около 10 месеца тази хирургична процедура е довела до дълбока загуба на тегло и драматично подобрение на инсулиновата чувствителност, както е показано чрез значително намаляване на средния HOMA-IR от 7,4 на 1,7 ( P = 0,02). За разлика от това, серумните нива на IL-6 не се различават преди или след периода на проучването, което показва, че през този 10-месечен период бариатричната хирургия е в състояние да подобри метаболитната функция, но не е в състояние да намали системното нискостепенно възпаление (Фиг. 5С). По отношение на хипоталамуса, MBH T2 хиперинтензивността (L) не се нормализира значително след интервенцията (Фиг. 5D). Също така не може да се наблюдава значителна разлика в коефициента на NAA/Cr (L), което показва съпоставим брой неврони преди и след периода на наблюдение (P = 0,17).

Бариатрична хирургия преди (T0) и след– (T1). Пациентите с тежко затлъстяване, претърпели бариатрична операция (n = 10), показват значително подобрение на ИТМ и HOMA-IR, но не и в интензивността на IL-6 или MBH-T2 след средно време за проследяване от 10 месеца. Двама отпаднали са напуснали проучването поради клаустрофобия по време на измерванията на ЯМР, а в някои случаи не са налични фенотипни данни A: n = 8. B – D: n = 7. Двойни двустранни t тестове (A, B и D) и беше приложен тест за ранг с подпис на Wilcoxon (C). Данните се показват като средно (SD).

Дискусия

В предишни проучвания върху затлъстяването, MBH T2 хиперинтензивността като мярка за HI е била латерализирана в лявото полукълбо (9,11), което е възпроизведено в нашето проспективно проучване (Фиг. 2). Въпреки че бихме могли да изключим асоциация с лява и дясна ръка, забележимо е, че други хипоталамусни функции, особено парасимпатичен отток, са латерализирани в лявата част на мозъка (22). В допълнение към предишните ни наблюдения, нашите резултати показват, че левият MBH физиологично има по-нисък интензитет на ЯМР T2 в сравнение с десния (фиг. 2А, бели ленти). Интензивността на ЯМР корелира не само с увеличен брой глиални клетки, но и с по-малък брой неврони (23). Това предполага, че левият MBH при здравословни условия може да съдържа по-голям брой неврони и следователно може да доминира над десния MBH в регулирането на автономните функции.

Констатациите от настоящото проучване показват, че HI и глиозата са по-свързани с цялостното системно нискостепенно възпаление при затлъстяване, отколкото с метаболитни аномалии, например инсулинова резистентност. Това е за разлика от предишно проучване, в което се отчита значителна връзка на хиперинтензивността на MBH T2 с периферната инсулинова резистентност (11). В този доклад обаче не са измерени възпалителни биомаркери и не е извършена намеса за отслабване; следователно може да не е било окончателно възможно да се разсъждава върху възпалителните и метаболитните фактори по отношение на тяхната роля в HI и глиозата. В допълнение, при експерименти с животни е показано, че HI продължава увеличаването на телесното тегло (9), което също предполага, че патологията на MBH не е резултат от свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност.

Няколко животински модели показват, че хранителните фактори, като диета с високо съдържание на мазнини, предизвикват HI и глиоза (8,9). Освен това е известно, че храненето влияе силно върху чревния микробиом (31,32). По този начин ние след това изследвахме дали макронутриентите са свързани с изобилието на двата чревни микроба, за които е установено, че са свързани с MBH T2 хиперинтензивност. Интересното е, че за Parasutterella sp. установихме, че по-високото съдържание на мазнини в диетата е значително свързано с по-ниско изобилие на бактерията. Тъй като по-ниският брой на бактериите е свързан с по-високо съотношение на сигнала MBH/амигдала, тези открития предполагат път, при който храненето чрез чревния микробиом може да повлияе на HI и глиоза. От значение е изобилието от Parasutterella sp. се свързва с приема на мазнини, но не и с общия енергиен прием, което отново предполага, че не калоричният прием и/или фенотипът на затлъстяването сам по себе си предизвиква HI, а по-скоро някои макронутриенти и микробни видове в червата. Това предполага, че при хората, както и при животински модели (9), промените в оста на червата и мозъка не са резултат от затлъстяване, а по-скоро могат да предизвикат нарушаване на регулацията на апетита и ситостта и следователно могат да бъдат причините за увеличаването на телесното тегло.

Трябва да се посочат няколко ограничения на нашето проучване. 1) предоставяме само данни за асоциации и корелации и следователно не можем да докажем причинно-следствената връзка; 2) вокселите в хипоталамуса (L), които са били използвани за MRS анализи, могат да имат променливо припокриване с короналните области на интерес (ROI), поставени за съотношението T2; 3) хранителни данни са получени чрез самоотчетени въпросници и следователно могат да бъдат предубедени; и 4) броят на субектите, подложени на бариатрична хирургия, може да е бил твърде малък за откриване на значителни ефекти върху HI.

В заключение представяме проспективно транслационно изследване на ролята на HI и глиозата в човешкото затлъстяване. Нашите открития предполагат, че HI в бъдеще може да се разглежда като допълнителна диетична и/или фармакологична цел за лечение, за да се засили ефектът от бариатричната хирургия и нехирургичните терапии за затлъстяване, особено във фазата на поддържане на теглото.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на всички пациенти и контролните субекти за участието в проучването. Авторите благодарят на д-р Робърт Семпъл от университета в Кеймбридж за корекцията на ръкописа. Освен това авторите благодарят на групата за обучение на изследователи 1743 „Гени, околна среда и възпаление“, финансирана от Германската изследователска фондация (Deutsche Forschungsgemeinschaft [DFG]) за подкрепата им.

Финансиране. Изследването е подкрепено с безвъзмездна помощ от Федералното министерство на образованието и научните изследвания (Bundesministerium für Bildung und Forschung [BMBF]) в Германия (FoCus, № 0315540A). Институтът по медицинска информатика и статистика е подкрепен от DFG (FOR2107).

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.