Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Разстройството на феталния алкохолен спектър (FASD) обхваща редица физически аномалии и аномалии в развитието, които са резултат от излагане на етанол по време на бременност. Предполага се, че FASD засяга 1% от всички живородени (1). Феталният алкохолен синдром (FAS), най-тежката проява на FASD, е водещата известна причина за умствена изостаналост в западния свят (2). Честотата на FAS се оценява консервативно на 0,97 на 1000 раждания (2) и може да достигне до 43 на 1000 живородени за силно пиещи бременни жени (3). Аномалии в малкия мозък са забелязани за първи път от Джоунс и Смит при аутопсията на дете с FAS (4). Намалени обеми на малкия мозък при пациенти с FASD са отбелязани оттогава в множество проучвания (5-9). Заедно с тези малки дефекти на малкия мозък, функцията на малкия мозък също се нарушава от пренаталната експозиция на етанол. Деца и възрастни с FASD имат церебеларна дисфункция; включително промени в походката, постурален баланс, двигателна координация и кондициониране на очите (10-12).

Работата върху животни потвърждава откритията при хората. Клетките на малкия мозък Purkinje са особено уязвими към причинена от етанол смърт или увреждане по време на постнаталния период при плъхове (13-15), а броят както на малките клетки на Purkinje на малкия мозък, така и на невроните на малките гранули на мозъка е значително намален (16). Развиващият се малък мозък изглежда особено уязвим за еднократна доза алкохол около постнаталния ден (P) 5 с паралелни загуби в невроните на Purkinje и гранули (17; 18). Мозъчно зависими поведенчески промени се наблюдават и след излагане на етанол по време на постнаталния период, включително дефицити на успоредки, кондициониране на окото и преминаване на дюбели (19-22).

Холинът, лецитинът (фосфатидилхолин) и цитихолинът (цитидин дифосфат-холин) са изследвани като цереброактивни лекарства от началото на 1980 г. (23). Ефектът на холина върху подобряване на ефектите от излагане на алкохол в развитието е описан за първи път от Thomas et al. (24). Холинът подобрява някои поведенчески ефекти на етанола, когато се дава едновременно или след излагане на етанол; например, може да подобри обучението по дискриминация, хиперактивността и проследяването на условията за мигане (19; 24-28). Това лечение обаче няма ефект при смекчаване на ефектите от етанола върху две поведения, зависими от малкия мозък; забавяне на кондиционирането на окото и моторната координация (19; 29).

Холинът може също така да предпази от структурни и биохимични дефицити, причинени от излагане на етанол. В in vitro модел на неврони на малките гранули на малкия мозък етанолът намалява L1 клетъчната адхезионна молекула (L1) -зависим невритен израстък и сигнализация надолу по веригата (30-32). Допълването с холин преди излагане на етанол показва подобрен невритен израстък и сигнализация в присъствието на етанол (30). Проведохме настоящото проучване, за да определим дали добавянето на холин преди остро излагане на етанол на P5 ще намали ефекта от етанола върху теста за преминаване на дюбели, тест за баланс и координация, който разчита силно на нормалната функция на малкия мозък при мишки (21).

МЕТОДИ

Животни; пренатално лечение

Мишките C57Bl6/J се поддържат в акредитирано от AAALAC съоръжение в Медицинския факултет на Университета в Мериленд. Стаите бяха контролирани от температура (22 ° C) с 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлините светват от 07:00 до 19:00). Всички процедури бяха извършени с предварително одобрение от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) към Университета на Мериленд, Балтимор и бяха в съответствие с насоките за грижа за животните, създадени от Националните здравни институти.

Мишките бяха настанени по двойки, една жена и един мъж. Ежедневно женските се проверяват за признаци на сперматозоиден положителен щепсел. Първата сутрин беше видяна запушалка, определена като ембрионален ден (Е) 0,5. От E4.5 до отбиването на малките на постнаталния ден (P) 21, язовирите получиха диета с дефицит на холин (518753, Dyets, Bethlehem PA). След отбиването язовирите бяха върнати на нормална диета за една седмица преди друг цикъл на чифтосване. Малките се държат на диета с пелети с дефицит на холин до тестовия ден.

Следродилни животни; лечение преди експозиция

В рамките на два дни след раждането малките бяха псевдослучайно разпределени в една от осем групи, така че максимум един мъж и една женска от всяко котило бяха разпределени в една група. Постнаталните лечения са били 2 (преди експозиция) × 2 (експозиция) × 2 (след експозиция): леченията преди приложението на етанол са физиологичен разтвор (10 μL нормален физиологичен разтвор (0,09% натриев хлорид)) или холин (10 μL от 18,8 mg/ml холин хлорид; C7527, Sigma, St Louis MO), прилагани подкожно веднъж дневно от P1 - 5 (ден на раждане = P0) в 9 ч. Сутринта.

Следродилни животни; излагане

Експозицията беше етанол (6,0 g/kg) или Intralipid® (I-141, Sigma), дадени в две разделени дози с интервал от два часа чрез интрагастрален сондаж на P5, 1 h след инжектирането на холин или физиологичен разтвор. Етаноловият разтвор се приготвя до крайна концентрация от 13,6% (v/v) в Intralipid® и разтворът без етанол се прави изокалоричен чрез добавяне на 202 mg малтоза-декстрин към Intralipid®. Всички малки бяха извадени от язовира и поставени на 37 ° C подгряваща подложка за 10 минути, докато цялата постеля беше обезкосмена. Всяко кученце е обзето със стерилна туба Clay Adams 7401, свързана към спринцовка Hamilton. Върхът на сондата се потапя в царевично масло (Sigma) за смазване, след това тръбата се насочва внимателно надолу по хранопровода в стомаха и разтворът за хранене бавно се инжектира. Малките бяха върнати на язовира веднага след обезкосмяването на последното животно. Този процес се повтаря за втората доза етанол. Приблизително 10 минути отнемаха всяко котило. 100% от животните са оцелели в деня на приложение на етанол.

Следродилни животни: лечение след експозиция

Леченията са физиологичен разтвор или холин хлорид, както е дадено веднъж дневно от P6 - 20.

Концентрации на алкохол в кръвта

Четири животни бяха дадени с етанол, както по-горе, и бяха евтаназирани на 2 или 4 часа след втория сонда и концентрацията на етанол в кръвта беше определена от етанол L3K (Diagnostic Chemicals Limited, PE, Канада).

Тест за преминаване на дюбели

Шест животни на пол за група за лечение бяха тествани на P30. Те бяха привикнали в помещение за изпитване, осветено с червена светлина за поне 1 час преди тестването. Апаратът за балансиране се състои от хоризонтално ориентиран дюбелен прът (0.635 cm диаметър × 120 cm дължина), който е маркиран на интервали от 3 cm и е окачен на около 75 cm над пластмасова покрита възглавница вътре в кутия за хващане (90 × 42 × 17 cm) . В единия край беше поставена затъмнена кутия за бягство (21 × 10 × 17 см). Преди първото изпитание субектите бяха поставени на 9 см от кутията на вратата и им беше позволено да влязат и да привикнат до кутията за врата за 1 минута, преди да се върнат в домашната клетка за интервал от 30 проби между.

На субектите бяха дадени 5 опита за пресичане на шпилката. По време на всяко изпитание животното се поставяше срещу вратата на пръта в началната позиция от 111 см и му се позволяваше да пътува на пръта до вратата. Всяко изпитание завършваше, когато мишката падна или се подхлъзне и окачи окачена на дюбела. За мишки, които достигнаха до вратата, им бяха дадени 10 секунди в вратата, преди да бъдат поставени отново в началото и им беше позволено да преминат отново. След 5 опита мишките бяха върнати в домашната клетка. Изминатото разстояние за всяко от 5-те изпитания се сумира, за да се получи общото изминато разстояние (см). Общото изминато разстояние беше използвано като мярка, зависима от постиженията.

Статистика

Всички данни се отчитат като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Данните за телесното тегло се анализират независимо за всяка възраст, като се използва двустранен дисперсионен анализ (ANOVA) с факторите пол и група на лечение. За данните за кръстосване на дюбели беше извършен първоначален двупосочен ANOVA (секс и група за лечение като фактори) с последващи еднопосочни ANOVA в секса. След това данните бяха допълнително разделени на четири групи, определени по пол и експозиция на P5. Един от начините за провеждане на ANOVA за тестване на априорната хипотеза, че лечението с холин ще подобри резултатите при животни, изложени на етанол, но не и при контролни животни. Когато ANOVA установи значителен ефект, беше проведено post hoc тестване по двойки с помощта на теста за най-малка значима разлика на Fisher’s, за да се сведе до минимум възможността за грешка от тип II („фалшиво отрицателно“ (33)). За непараметрични данни се извърши еднопосочен ANOVA на ранговете, използвайки теста на Крускал-Уолис, последван от post hoc U тестове на Mann Whitney. За всички тестове статистическата значимост е настроена на алфа ≤ 0,05. Статистическият софтуер беше SigmaPlot v.12.3 (Systat Software Inc., Сан Хосе Калифорния).

Съответните сравнения между осемте групи на лечение се считат за сравнения между групи, споделящи условията на експозиция (т.е. в рамките на групите Intralipid® или етанол) или ако те споделят условията преди и след експозиция (напр. SIC срещу SEC). Други сравнения (например SIS срещу SEC) не са описани.

РЕЗУЛТАТИ

холин

Общо пресичано разстояние в теста за преминаване на дюбели за женски и мъжки мишки. Язовирите бяха поставени на диета с недостиг на холин на ембрионален ден 4,5, докато малките бяха отбити. Кученцата са били на диета с недостиг на холин, докато бъдат тествани. На малките бяха дадени 5 опита за пресичане на дюбела. Дължината на пресечения дюбел за всяко от 5-те изпитания беше добавена, за да се даде общото изминато разстояние. Жените са преминали значително по-големи разстояния от мъжете за всяка лекувана група, поради което графиките представят ефекта от третираната група във всеки пол. Група за лечение: XYZ - X е или физиологичен разтвор (S), или холин (С) от P1 - P5; Y е или Intralipid® (I), или етанол (E) на P5; Z е или физиологичен разтвор (S), или холин (C) от P6 - P20. Лентите представляват средното общо разстояние за всяка третирана група (n = 6) ± SEM. Статистическият анализ е показан в таблица 2 .

Таблица 2

Статистически анализ за пресичане на дюбели, общо разстояние.

EffectDovel пресичанеAllANOVA F1,80 = 4,749, p = 0,032 * пол; F7,80 = 13,774, p * получер указва значителен ефект

Женски

Първо направихме двойно сравнение на ефекта на етанола върху всяка от четирите третирани групи (S или C предварителна експозиция, S или C след експозиция; Таблица 2). Етанолът значително намалява общото разстояние във всяка третирана група.

След това изследвахме ефекта на холина върху изложени на Intralipid® женски животни. Няма значителна разлика (F3,20 = 2,549, p = 0,085) сред изложените на Intralipid® женски групи.

Бележки под линия

Конфликт на интереси: Всички автори са служители на Университета на Мериленд, Балтимор; SMM получи финансова подкрепа, за да присъства на срещата на Детската здравна мрежа за 2015 г.; CFB получи безвъзмездно финансиране от Gerber. Няма конфликт на интереси.