Зейнеп Мадак Ердоган

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и човешкото хранене, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Пинг Гонг

2 Катедра по молекулярна и интегративна физиология, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Йиру Чен Жао

2 Катедра по молекулярна и интегративна физиология, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Liwen Xu

2 Катедра по молекулярна и интегративна физиология, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Kinga U. Wrobel

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и човешкото хранене, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Джеймс А. Хартман

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и храненето на човека, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Мишел Уанг

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и храненето на човека, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Антъни Кам

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и човешкото хранене, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Уршула Т. Иванец

4 Лаборатория по скелетна биология, Училище за биологични и популационни здравни науки, Орегонски държавен университет, Корвалис, OR 97331, САЩ

Ръсел Т. Търнър

4 Лаборатория по скелетна биология, Училище за биологични и популационни здравни науки, Орегонски държавен университет, Корвалис, OR 97331, САЩ

Нейтън С. Туадъл

5 Национален център за токсикологични изследвания, Джеферсън, AR 72079, САЩ

Даниел Р. Доерж

5 Национален център за токсикологични изследвания, Джеферсън, AR 72079, САЩ

Ихлас А. Хан

6 Национален център за изследване на природни продукти, Училище по фармация, Университет в Мисисипи, Университет, MS 38677, САЩ

7 Отдел по фармакогнозия Катедра по биомолекулярни науки, Фармацевтично училище, Университет в Мисисипи, Университет, MS 38677, САЩ

Джон А. Каценеленбоген

3 Катедра по химия, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Бенита С. Каценеленбоген

2 Катедра по молекулярна и интегративна физиология, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Уилям Г. Хелферих

1 Ботанически изследователски център, Департамент по наука за храните и човешкото хранене, Университет на Илинойс в Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Резюме

Обхват

Изследвахме въздействието на хранителните добавки с компоненти от сладък корен върху индуцирано затлъстяване, натрупване на мазнини и чернодробна стеатоза при мишки с овариектомизирани C57BL/6 като модел на менопаузата.

Материали и методи

Оценихме молекулярните и физиологичните ефекти на диетичния корен от женско биле, прилаган на мишки с яйчници C57BL/6 като корен на прах (LRP), екстракти (LRE) или изолиран изоликвиритегенин (ILQ) върху репродуктивните (матката и млечната жлеза) и нерепродуктивните тъкани, важни в регулиране на метаболизма (чернодробна, перигонадна, периренална, мезентериална и подкожна мазнина). Количествените изходни мерки, включително телесно тегло, разпределение на мазнините (MRI), консумация на храна, костна плътност и тегло (DXA) и експресия на гена, се оценяват по степента на възстановяване до здравословното състояние в пременопауза. Характеризирахме хистологични (H&E и оцветяване с маслено червено O) и молекулярни свойства (експресия на определени маркери на заболяването) на тези тъкани и ги съпоставихме с метаболитен фенотип, както и нива на биоактивни вещества в кръвта.

Заключения

Въпреки че LRE и ILQ осигуряват известна полза, LRP е най-ефективен за намаляване на наддаването на телесно тегло, общото отлагане на мазнини, чернодробната стеатоза и експресията на гени за чернодробен липиден синтез след овариектомия. Нашите данни показват, че коренът от женско биле е осигурил подобряване на множество метаболитни параметри при условия на менопауза с нисък естроген и диети с високо съдържание на мазнини, без да стимулира репродуктивните тъкани.

1. Въведение

Повишената смъртност, свързана със сърдечно-съдови заболявания (ССЗ), свързана със затлъстяването и диабета, прави тази триада един от най-големите проблеми на общественото здраве и причина номер едно за заболеваемост сред жените в САЩ [1]. За жените в пременопауза рискът от диабет и ССЗ е наполовина по-малък от мъжете, но след менопаузата честотата на метаболитни заболявания и ССЗ се удвоява при жените, като в крайна сметка достига тази при мъжете [1]. С намаляването на нивата на естроген в менопаузата се наблюдава увеличаване на коремните мазнини, инсулиновата резистентност и рисковите фактори за ССЗ [2–4]. Заседналият начин на живот, ограничената подвижност и богатите на мазнини и захар диети в съчетание с ниски естрогени при жени в менопауза влошават този проблем, правейки жените в постменопауза по-податливи на метаболитен синдром и свързания с него диабет и ССЗ [2, 5, 6].

Соята и соевите изофлавони все още са най-широко използваните ботанически естрогени (BE) и въпреки че са били обект на значителни изследвания, все още има някои противоречия около действията им [9, 11, 13-16]. Освен соята, ботаническите хранителни добавки, съдържащи корен от женско биле, се приемат от жени, които искат да поддържат здравето си и да търсят облекчение от симптомите на менопаузата. Всички тези растителни продукти са известни или се съобщава, че съдържат съединения с естрогенна активност, но, подобно на соята, тези съединения са структурно много различни от стероидните естрогени в ХЗТ и следователно е вероятно да имат механично различни действия. Коренът от женско биле, който показахме по-рано, че съдържа изоликвиритигенин, действа като естроген с нисък афинитет чрез ERα [17, 18]. Сладникът съдържа флавоновия ликвиритигенин (LIQ), който е в динамично равновесие с изомерния халкон изоликвиритигенин (ILQ) [19]. От нашата работа [18] и тази на други [19], основните цели на пренилфлавоноидите най-вероятно са ER, въпреки че предпочитанията им за ERβ са по-малки от тези на соевите изофлавони [18], което предполага участието на други механизми.

женско

(А) Хипотеза за преференциално действие на BE в нерепродуктивни тъкани спрямо репродуктивни тъкани. (Б) Дизайн на изследването. Мишките C57BL6 (8/група) са били хранени или с контролна диета AIN76A (нормална диета с ниско съдържание на мазнини, 16% Kcal от мазнини), или с диета с високо съдържание на мазнини (HFD, 45% Kcal от мазнини) в продължение на 2 седмици и след това са преминали към диети, съдържащи без ботанически корен от женско биле (контрол), прах от корен от сладник (LRP), екстракт от корен от сладник (LRE) или изоликвиритигенин (ILQ) в продължение на 5 седмици преди анализи на тъкани и кръв

2. Материали и методи

2.1 Животни и диети

За да тестваме въздействието на BE върху устойчивостта към затлъстяване и метаболитно здраве след менопаузата, използвахме мишки с овариектомия C57BL/6, които бяха хранени с високо съдържание на мазнини и сравнихме параметрите и при животни на контролна диета. Това е често използван метод за индуциране на метаболитно заболяване, свързано с менопаузата при мишки [21-23]. Тъй като нормалната чау обикновено съдържа изофлавони, които могат да имат естрогенни дейности, които могат да отменят метаболитните ефекти на овариектомията, ние използвахме полу-пречистена AIN76A (Harlan, CA.170481) диета, която не съдържа фитоестроген и има казеин като източник на протеин. Диетата с високо съдържание на мазнини за тези проучвания (Harlan TD.88137) се нарича „западна диета“ и се основава на диета AIN76A (45% Kcal от мазнини). Той е с високо съдържание на маслена мазнина със захар и малко холестерол (0,2%) и е разработен за метаболитни изследвания [21, 22]. Диетите с много високо съдържание на мазнини (60% Kcal от мазнини) не се използват за предизвикване на затлъстяване, тъй като искахме да проучим съпоставимо ниво на мазнини, консумирани от хората в САЩ (

34% Kcal от мазнини; NHANES). За тези проучвания използвахме 8-10 седмични женски животни, овариектомирани, които бяха рандомизирани към нормална и високомаслена диета плюс различни BE, допълнени в храната и наблюдавани в продължение на няколко седмици.

2.2 Администриране на BE и дози

Всички BE, използвани в тези проучвания, са предоставени от Ботаническия център към Университета в Мисисипи. Идентичността и чистотата на всички ботанически компоненти са проверени чрез хроматография и спектроскопия от същата група, както е направено в предишни проучвания [18]. BE се прилагат на лабораторни животни чрез гранулирана диета за гризачи, базирана на AIN76, в която компонентите на корена на сладника са включени или като прахове, изсушени метанолови екстракти или основни активни компоненти. Тъй като ЛЕГЛАТА се консумират от хората като прахове, екстракти и фракционирани продукти, ние вярваме, че този подход трябва да даде реалистична представа за това какви ефекти могат да се очакват при хората. Администрирането на BE в храната също е много практично и с гранулирани фуражи можем да определим количествено консумацията на храна. Според нашия опит ежедневното дозиране на животни чрез сонда често води до стрес и намалена консумация на храна, което сериозно обърква експерименталните резултати и поради това не се използва.

2.3 Идентифициране на компонентите на женско биле корен в кръвта

Вътрешната дозиметрия на LIQ и ILQ беше оценена в серум от възрастни женски мишки C57Bl/6, събрани по време на умъртвяване след 5 седмици по съответните диети. Утвърден метод LC/MS/MS с количествено определяне по вътрешен стандарт (d3-daidzein и d4- генистеин за LIQ и ILQ, съответно) е използван за количествено определяне на общите конюгирани и агликонови форми на LIQ и ILQ (виж Таблица 1, граници на откриване 0,0002–0,006 µM в зависимост от анализирания обем), съответно без и с ензимна хидролиза (n = 8 –10 мишки). Времето на жертвоприношение по отношение на последната консумация на дозирани диети не е известно, така че еднократните оценки съдържат значителна несигурност относно максималните серумни концентрации и вариабилността между животните.

маса 1

Кръвни нива на LIQ и ILQ, като общо и агликони, при животни на контролни диети (C) или диети с високо съдържание на мазнини (HF), съдържащи прах от корен от женско биле (LRP), екстракт от корен от женско биле (LRE) или чист изоликвиритигенин (ILQ).

За да проверим нашата хипотеза, разделихме 10-седмични овариектомизирани мишки от див тип C57BL6 на две диетични групи. Диетите са формулирани както в нормална, така и с високо съдържание на мазнини, като последните осигуряват диетичен стрес, често срещан при хората. Едната група продължи с нормална диета (AIN76A), докато втората група беше поставена на диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 2 седмици. Животните в групите, контролирани от носителя и третирани с Е2 (5 µg/ден; пелети, съдържащи 0,125 mg Е2), получават пелети подкожно, съответно, докато животните, третирани с различни компоненти от корен от женско биле, получават добавките BE в храната си. Диетичното хранене на BE е разумно приближение на ежедневната употреба на BE като хранителни добавки, приемани от жени под формата на хапчета веднъж или няколко пъти дневно.

Установихме, че чрез съпоставяне на концентрациите в плазмата на лабораторните животни с тези, открити при хора, консумиращи BEDS (когато са известни), ние сме в състояние да определим най-подходящите дози за нашите изследвания. По принцип BE се прилагат в диетата в доза от 5% w/w от кореновия прах, 0,5% от изсушен метанолов екстракт или по-малко количество основни компоненти на екстракта (Фигура 1B). В тази форма LRP осигурява най-високата кръвна концентрация на LIQ и ILQ както в общата, така и в агликоновата форма (Таблица 1). Таблица 1 показва, че диетите LRP и LRE са произвели сходни серумни нива на LIQ и ILQ агликони в nM диапазона, като нивата на LIQ са постоянно по-високи от ILQ, което вероятно отразява съотношението флаванон/халкон в G. uralensis [27], както и известна взаимна конверсия между тези две изомерни вещества [35]. Диетата, съдържаща пречистен ILQ, произвежда серумни нива на ILQ в същия диапазон като LRP и LRE диетите. Консумацията на пречистената диета с ILQ също води до измерими нива на LIQ в серума, но тези нива са приблизително 10 пъти по-ниски от тези за ILQ. Агликоните са били постоянно под 1% от общия LIQ и ILQ, присъстващи в серума за LRP и LRE диети, което е в съответствие с екстензивния метаболизъм във фаза II след поглъщане.

В нашето проучване върху корен от женско биле (LR), като прах (LRP), екстракт (LRE) и чист изоликвиритигенин (ILQ) установихме, че както E2, така и LRP са ефективни при нормализиране на теглото при контролни и западни (с високо съдържание на мазнини) диети. (Фигура 2А), главно поради промени в цялостното затлъстяване (Фигура 2Б), но не и чиста маса (Фигура 2С), както е потвърдено чрез ядрено-магнитен резонанс на цялото тяло (ЯМР). Този резултат е в съответствие с кръвните нива на биоактивни агликонови форми, показани в Таблица 1, и предполага, че тези разлики вероятно ще станат изразени при по-високи дози LRE или ILQ в диетата и вероятно с по-дълги времена на лечение.

(A) Общо тегло на животните на различни диети, допълнени с BE. Двупосочен ANOVA, Bonferroni posttest, * P Фигура 3). Животните, които са били на диета с високо съдържание на мазнини, консумират по-малко храна (Фигура 3А), но енергийният прием е подобен (Фигура 3Б). Както се очаква, E2 намалява приема на храна както при нормални, така и при групи с високо съдържание на мазнини (Фигура 3B). Диетите, съдържащи компоненти на женско биле, обаче, не променят приема на храна (Фигура 3B), което показва, че това не е определящо за различните телесни тегла и промени в депата на мазнини. По този начин, нашите проучвания показват, че BEs от корен от женско биле са много ефективни за нормализиране на наддаването на тегло, свързано с овариектомия при нормални и високомаслени диети и BEs намаляват затлъстяването на мишките при нормална и високомаслена диета, без да влияят на чистата маса.

(A) Тегло на матката и няколко мазнини от животни на различни диети, допълнени с BE. (B) BEs не индуцират експресия на Е2 реагиращи гени в матката или млечната жлеза. (C) BE не предизвикват разклоняване на млечната жлеза. (D) BE не влияят върху костната маса. Двупосочен ANOVA, Bonferroni posttest, * P Фигури 5, 6). 6). Отстраняването на естрогени чрез овариектомия, комбинирано с диета с високо съдържание на мазнини, увеличава общото затлъстяване в перигонадната мастна тъкан, а лечението с E2 или LRP значително намалява размера на адипоцитите, както се наблюдава при H&E оцветени тъканни участъци (Фигура 5А). В допълнение към тези маркери, ние също наблюдавахме SCD1 [38] и FABP1 в мастната тъкан [39]. Тези промени са в съответствие с H&E оцветяването и предполагат превантивна роля за LRP и LRE при отлагане на липиди с високо съдържание на мазнини в адипоцитите. И двата коренови компонента E2 и женско биле (прах от корен, екстракт или ILQ) модулират гените, които са критични за отлагането на липиди.

(А) Хистология на перигонадната мастна тъкан от животни на диета с високо съдържание на мазнини, допълнена с контрол, E2, LRE, LRP или ILQ. (B) Анализ на генната експресия на различни мастни депа от животни на диета с високо съдържание на мазнини, допълнена с различни BE. t-тест, * P Фигура 6A) и оцветяване с маслено червено O (Фигура 6B) на чернодробни секции от третирани животни. Нещо повече, теглото на черния дроб се увеличава чрез диета с високо съдържание на мазнини и това се отслабва от лечението с Е2 и BEs (Фигура 6С). Това ектопично натрупване на липиди напомня на неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) или чернодробна стеатоза, предизвикана от затлъстяване и диета с високо съдържание на мазнини при хора и гризачи [40–42], което предразполага индивида към диабет тип 2 и сърдечно-съдови заболявания [ 43–45].

Проверихме молекулярните промени в пътищата на синтез на мастни киселини, като проследихме два биомаркера на чернодробната стеатоза, FASN [46, 47] и SREBP-1c [48, 49], и установихме, че нивата на експресия на тези гени са намалени с лечения с E2 и LRP (Фигура 6D) предполагащ инхибираща роля за ERα за тези пътища. За да докажем допълнително, че BE от корен от женско биле работят чрез ERα, ние лекувахме HepG2 клетки, които стабилно експресират ERα или първични хепатоцити на мишка с E2, ILQ или LIQ. Като цяло ефектът на ILQ и LIQ е по-изразен при HepG2-ERα клетки в сравнение с първичните хепатоцити. Въпреки разликите в нивото на отговор на лигандите ERα антагонистът фулвестрант е много ефективен при блокиране на понижаването на регулацията на SREBP1c от E2 и BEs, което предполага, че те действат чрез чернодробна ERα (Фигура 6Е). По този начин нашите изследвания предоставят механистична основа за селективни BE действия чрез ERα.

4. Дискусия

Изследвахме тъканно-селективните действия на компонентите на женския корен от женско биле количествено, на морфологични, физиологични и генни регулаторни нива. Тези резултати показват, че LRP храненето в диетата, което осигурява най-висока концентрация на ILQ като общ и агликони, отразява действието на Е2 в метаболитните тъкани чрез нормализиране на наддаването на тегло след овариектомия, намалява общото отлагане на липиди в тялото и намалява чернодробната стеатоза без стимулиране на млечната жлеза или матката. Тези ефекти се дължат на въздействието на BE корен от сладък корен върху мастния компонент на тялото и не зависят от промените в приема на храна. Въпреки че добавянето на BEs с BEs в диетата не променя приема на храна, в края на проучването тези животни са натрупали по-малко тегло в сравнение с контролните животни.

От тези експерименти за хранене с BE и последвалите анализи, ние получихме голямо количество данни за морфологични, физиологични, биохимични и генни експресии, от които можем да направим оценка на тъканно-селективните ефекти на различни BE върху метаболитните параметри. По-специално отбелязахме потенциала на BE за поддържане на здравословно метаболитно състояние при условия на ниско ниво на естроген (като модел на менопаузата) и в същото време наблюдавахме малко потенциални рискове при стимулиране на репродуктивните тъкани. Резултатите от тези проучвания за хранене с BE, направени при животни, профилите на генната експресия и анализите на пътищата в различни целеви тъкани и проучвания на клетъчни култури разкриха механистични аспекти на основните молекулярни механизми, които могат да обяснят тъканно-селективните ERα медиирани ефекти, които наблюдавахме с БЕ.