Експресия на гени чрез qRT-PCR на гени, идентифицирани чрез анализ на микрочипове в микросъдове на хипокампа. Единадесет гена (Npy, Taf1d, Trp53rka, Egln1, Arrb1, Aph1a, Fabp5, Slc17a5, Rap1b, Clca4a, MAPK8) бяха тествани чрез qRT-PCR в микросъдовете на хипокампата, изолирани от див тип (WT) и LDL-R -/mice хранени с контролна диета (CD) и западна диета (WD) и показват същата тенденция в генната експресия като микрочиповете. Нивата на изразяване са изразени като log2-кратна промяна (* p ≤ 0,05 за WT-WD, LDL-R -/- CD и LDL-R -/- WD в сравнение с WT-CD).

безплатни

Анализ на генната мрежа на диференциално експресирани гени, кодиращи протеини в микросъдове на хипокампа. Алгоритъм за извличане на текст (Metacore) е използван за извършване на анализи на генната мрежа и идентифициране на функционални групи на диференцирано експресираните гени, кодиращи протеини в микросъдовете на хипокампуса от мишки C57BL/6J (WT), хранени със западна диета (WD) в сравнение с контрола диетични (CD) хранени WT мишки, CD-хранени LDL-R -/- мишки в сравнение с CD-хранени WT мишки и WD-хранени LDL-R -/- мишки в сравнение с CD-хранени WT мишки. Тези генни мрежи, представени в кръговата диаграма, са участвали в клетъчната адхезия (оранжево), цитоскелета (жълто), пролиферацията (кафяво), протеолиза (сиво), транскрипцията (тъмно зелено), развитието (светло синьо) и предаването на сигнала (тъмно синьо ).

Анализ на пътеките на пътищата на диференциално експресирани гени, кодиращи протеини в микросъдовете на хипокампа. Хистограма на значимите клетъчни пътища на диференциално експресирани гени, кодиращи протеини в хипокампалните микросъдове. Клетъчни пътища на диференциално експресирани гени в микросъдове на хипокампус от мишки, хранени със западна диета (WD) C57BL/6J (WT) в сравнение с WT мишки, хранени с контролна диета (CD), мишки, хранени с CDL, LDL-R -/- в сравнение с CD- хранени WT мишки и WD-хранени LDL-R -/- мишки в сравнение с CD-хранени WT мишки бяха идентифицирани с помощта на KEGG и MetaCore.

Диаграма на Вен на 30-те най-важни транскрипционни фактора, засегнати от диетата и генотипа в хипокампалния микросъдов ендотел. Транскрипционните фактори, потенциално модулирани от увреждане на липидите, бяха идентифицирани с помощта на алгоритъм за регулиране на транскрипцията на MetaCore. Диаграмата на Venn показва 17 транскрипционни фактора (TF), общи за мишките C57BL/6J (WT), хранени със западна диета (WD), LDL-R -/- мишки, хранени с WD, хранени с WD LDL-R -/- мишки, в сравнение с CD-хранени WT мишки.

Ефект на увреждане на липидите върху микроРНК насочва диференцирано експресирана експресия на генни пътища в хипокампалните микросъдове. Топлинна карта на диференциално експресирани генни пътища и миРНК целеви генни пътища. Сравненията на пътищата на диференциално експресирани гени и пътищата на миРНК целевите гени идентифицират група пътища като сигнальния път на хемокините, фокалната адхезия, междинната връзка, инсулиновата сигнализация, Nf-kB сигнализация или Gap връзките и пътищата, които регулират взаимодействието на ендотелните клетки и обща пропускливост. Представен е подробен представителният интегриран анализ на диференциално експресираните гени и целевите гени на диференциално експресираните miRNAs за сигналния път на фокалната адхезия. Синьо = диференциално експресирани гени; жълто = целеви гени на диференциално експресирани miRNAs; градация на цвета от синьо до жълто = идентифицирани гени, които са едновременно диференцирано експресирани и са мишени на диференциално експресирани miRNAs.

Протеин-протеинова мрежа, обогатена с транскрипционни фактори и регулация на miRNA. Протеин-протеиновите взаимодействия бяха идентифицирани с помощта на базата данни STRING от диференцирано експресирани гени. Взаимодействията между протеин-протеиновата мрежа, диференциално експресираните miRNAs (Mir 1192) и потенциалните транскрипционни фактори (Stat1, c-Myc, Creb1) са конструирани с помощта на онлайн инструмента OmicsNet. Целевите гени са: Pax6, Arrb1, Irf9, Il12rb1, Irf8, Epas1, Tlr9, Tbx21, Dag1, Atxn3, Med1, Etv6, Olig1, Ube2n, Pard3, Nphp4, Ubc, Ctcf, Msx1, Dxd58, Dxd58, Dxd58 Tcf3, Boon1, Pml, Zfp292, Dvl3, Ndn, Foxo1, Zfpm1, Rbbp4, Cul4a, Ywhaz, Arhoef7, Actef, Set, Pou5f1, Hist1hb4, Cbx2, Rxrb, Ywhae, Wnt7p2, Ln3n, Af.

Топлинна карта на пътните анализи на диференциално експресирани гени, миРНК целеви гени и lncRNA цели. Топлинна карта на пътищата, идентифицирани с помощта на базата данни KEGG, използвайки диференциално експресирани гени, целеви гени на диференциално експресирана miRNA и цели на lncRNA. Интензивността на цвета е пропорционална на броя на гените по пътя.

Регулиране на пътя на актиновия цитоскелет чрез диференциално експресирани гени, miRNA и lncRNA. (А) Интеграционен анализ, показващ диференциално експресирани гени (сини квадрати), диференциално експресирани miRNAs (кафяви квадрати) и техните цели (кафяви начупени стрелки) и диференциално експресирани lncRNAs (зелени квадрати) и техните цели (зелени счупени стрелки). Показани са и потенциални взаимодействия между гени, miRNA и lncRNA. (B) Амплификация на списъка с диференциално експресирани гени (подчертани в синьо), miRNAs и техните цели и lncRNAs и техните цели, регулиращи пътя на актиновия цитоскелет.

Резюме

1. Въведение

2. Методи

2.1. Експериментални животни

2.2. Анализи на метаболизма на кръвта и хормона

2.3. Изолиране и криосекция на миши мозъчен хипокампус

2.4. Микродисекция за лазерно улавяне (LCM) на хипокампалните микросъдове

2.5. Извличане на РНК от лазерно уловени мозъчни микросъдове

2.6. Хибридизация на микрочипове и анализ на транскриптома

28 000 кодиращи преписи и

7000 некодиращи преписи, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ). РНК (125 pg) се използва за приготвяне на cRNA и sscDNA, използвайки комплект Affymetrix GeneChip ® WT Pico. SscDNA (5,5 µg) се фрагментира от урацил-ДНК гликозилаза (UDG) и апуринова/апиримидинова ендонуклеаза 1 (APE 1) и се маркира с терминална дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT), като се използва ДНК маркиращият реагент, който е ковалентно свързан с биотин. След това фрагментирани и етикетирани ssCDNA проби в три екземпляра бяха подадени в ядрото на споделения ресурс на UC Davis Genome Center за хибридизация, оцветяване и сканиране с помощта на протокола за хибридизация на масива Affymetrix WT, следвайки протокола на производителя. Хибридизацията на фрагментираните и етикетирани ssCDNA проби беше извършена с помощта на GeneChip ™ Hybridization Oven 645, а пробите след това бяха измити и оцветени с помощта на GeneChip ™ Fluidics Station 450. Масивите бяха сканирани с помощта на GeneChip ™ скенер 3000 7G (Thermo Fisher Scientific, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Качественият контрол на микрочиповете е направен с помощта на софтуера Affymetrix Expression Console версия 1.4.1 и анализ на данни, извършен с помощта на софтуера Affymetrix Transcriptome Analysis Console версия 3.1.0.5.