Тецуо Накаджима

Изследователски център за радиационна защита, Национален институт по радиологични науки, Чиба, Япония

Гийом Варес

Изследователски център за радиационна защита, Национален институт по радиологични науки, Чиба, Япония

Бинг Уанг

Изследователски център за радиационна защита, Национален институт по радиологични науки, Чиба, Япония

Мицуру Неной

Изследователски център за радиационна защита, Национален институт по радиологични науки, Чиба, Япония

Замислени и проектирани експерименти: TN GV BW MN. Изпълнени експерименти: TN GV BW MN. Анализирани данни: TN GV BW MN. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: TN GV BW MN. Написа хартията: TN GV BW MN.

Свързани данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Резюме

Въведение

Човешкото здраве се влияе от избора на начин на живот, включително упражнения, диета и употреба на тютюн. Сред тези фактори консумацията на алкохол е свързана с многобройни рискове за здравето и заболявания, като сърдечно-съдови заболявания и рак [1]. Черният дроб е особено податлив на заболявания, свързани с алкохола [2], а по-високата консумация на алкохол е основна причина за хепатоцелуларен карцином [3]. Освен това, когато се комбинира с други рискови фактори, като тютюн, алкохолът може да има синергични ефекти върху здравето [4–7].

Радиацията също е важен здравен рисков фактор и е свързана както с остри, така и с хронични ефекти в зависимост от качеството и дозата на облъчване. Ефектите на радиацията върху човешкото здраве могат да бъдат медиирани, поне отчасти, от фактори, свързани с начина на живот, като диета [8–10]. Например констатациите от епидемиологични проучвания на работници от атомни централи предполагат, че факторите, свързани с начина на живот, включително консумацията на алкохол, влияят върху неблагоприятните ефекти на радиацията [11,12]. Въпреки това как употребата на алкохол по поръчка медиира радиационни ефекти остава неясно.

Много видове алкохолни напитки се консумират по целия свят. Въпреки че алкохолът като цяло е показал, че влияе неблагоприятно на човешкото здраве [2,13], някои напитки, включително бира и саке, са показали, че имат антимутагенни действия [14]. Наскоро беше съобщено, че популярната японска алкохолна напитка саке има защитни ефекти срещу остра радиация [15]. Остава обаче неизвестно дали хроничната консумация на саке медиира такива радиационни ефекти.

Черният дроб е основният орган, участващ в детоксикацията на вредни вещества, включително алкохол [16] и е податлив на радиационно увреждане [8,10,17]. Алкохолът се метаболизира в черния дроб и получените метаболитни странични продукти могат да нарушат функцията на черния дроб и да причинят увреждане на тъканите [18]. По тази причина чернодробните метаболити са полезни показатели за здравословното състояние.

Тук влиянието на хроничната консумация на саке върху индуцираните от радиацията ефекти, особено тези, свързани с промяната на чернодробните метаболити, беше оценено при мишки, използвайки метаболитен подход.

Материали и методи

Грижа за животните

Седем седмични женски мишки C3H/He са закупени от Japan SLC Co. (Хамамацу, Япония). Мишките бяха настанени в продължение на седем седмици, за да се даде възможност за адаптация преди извършване на експерименти. Обикновено на мишките беше разрешен достъп до вода и стандартна лабораторна чау (MB-1, Funabashi Farm Co., Япония) ad libitum. Основните компоненти на MB-1 (брутна енергия, 4.28 Kcal/g) са както следва: общ въглехидрат, 54.4%; протеини, 24,2%; мазнини, 4,4%; влакна, 3,6%; влага, 8,0% и пепел, 5,4%. Всички проучвания върху животни бяха прегледани и одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Националния институт по радиологични науки (NIRS) и бяха извършени в строго съответствие с Насоките на NIRS за грижа и използване на лабораторни животни. Общо 4 или 5 мишки бяха използвани във всяка група за приложение (саке или етанол). Измерванията на цялото телесно тегло, телесното тегло и метаболитните маркери бяха извършени с помощта на 3 (съответстващи на проби за анализ на метаболома) или 4 мишки във всяка група за приложение в два независими експеримента.

Администрация на Sake

Sake (junmai-shu; Daishichi Sake Brewery, Nihonmatsu, Japan), произведено с ориз, полиран до 69% и съдържащ 15% (v/v) алкохол, е използвано за изследване на ефектите на саке върху метаболома на черния дроб в това проучване. Като сравнително проучване за изследване на ефектите на етанола, 15% (v/v) етанол със специален клас (99,5%) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) във вода се прилага на мишки вместо саке.

Саке (0,2 или 0,6 ml на 23 g телесно тегло, съответстващо на 0,009 ml/g или 0,026 ml/g телесно тегло, съответно) се прилага на мишки с помощта на игла за хранене всяка сутрин в продължение на един месец (30–31 дни). Теглото на мишките се измерва всяка вечер и се използва за изчисляване на количествата саке на следващата сутрин. В сравнителни експерименти, използващи 15% етанол във вода, 0,6 ml етанолов разтвор се прилагат на мишки. Контролната група е получила същия обем питейна вода вместо саке. Преди да се приложат тестовите разтвори сутрин, храна и вода бяха задържани от мишки от предишната вечер. Мишките в облъчената група бяха облъчени през последните четири дни от периода на приложение на саке, както е описано в следващия раздел. Общо 4 или 5 мишки бяха използвани във всяка експериментална група за саке и етанол. S1 и S2 Фигури са представителни графики, показващи промени в телесното тегло на мишки, прилагани или саке, или 15% приложение на етанол. След даване на мишките по 0.6 ml саке на ден за един месец, брутният външен вид на мишките е нормален и не се наблюдават промени в теглото в сравнение с контролите; следователно, следните експерименти бяха проведени чрез прилагане на 0,6 ml саке на мишки, освен ако не е посочено друго.

Облъчване

Мишки, прилагани перорално саке всеки ден в продължение на един месец (0,6 ml на 23 g телесно тегло) се третират с фракционирано облъчване (0,75 Gy/ден). Облъчването се извършва веднъж дневно при скорост на дозата от 0,85 Gy/min през последните четири дни от периода на приложение на саке- или етанол непосредствено след приложението. Облъчването беше извършено с помощта на машина Pantak 320S (Shimadzu, Япония), оборудвана с 0.50 mm Al + 0.50-mm Cu филтър и работеща при 200 kVp и 20 mA. За дозиметрията е използван измервател на степента на експозиция (AE-1321M; Applied Engineering Inc., Япония). Вземането на кръв и органи се извършва един ден след последното облъчване. Мишките се анестезират чрез вдишване на газообразен изофлуран (Pfizer, Токио, Япония) и се събира кръв за приготвяне на серум. След това мишките бяха евтаназирани чрез дислокация на шийката на матката и проби от черен дроб, тимус и далак бяха събрани за анализ.

Анализ на метаболома

Анализ на свободни аминокиселини

Концентрациите на свободни аминокиселини в саке бяха определени с помощта на автоматизирана система за анализ на аминокиселини (JLC-500v2; JEOL Ltd., Япония). Пробните проби се приготвят чрез добавяне на 22 ml 0,1% 2-меркаптоетанол и 3 ml 50% TCA разтвор към всяка 5-g проба саке. След смесване, получените разтвори се държат в продължение на 3 часа върху лед и след това се центрофугират при 10 000 х g в продължение на 20 минути при 4 ° С. След филтриране на супернатантите през филтър № 5А (Advantec), 1 N NaOH (70 μl) се добавя към 1 ml филтрат и получените разтвори се разреждат 1: 3 (v/v) в първичния буфер на система за анализ. След филтриране през 0,45 μm филтър (DISMIC-13CP, Advantec), пробите се анализират. Всички процедури бяха извършени върху лед. Всички анализи са извършени от Центъра за изследвания и развитие на NH (Nipponham) Foods Ltd. (Цукуба, Япония).

Приготвяне на серум и анализ на биохимичен маркер

Събраната кръв се поддържа при стайна температура в продължение на 90 минути и след това се центрофугира при 1000 х g в продължение на 15 минути при 20 ° С. Получената супернатанта се събира като серум и се съхранява при -80 ° С, докато е необходимо за анализ. Метаболитните маркери в серума са анализирани с помощта на Dri-Chem 7000V (Fuji Film, Япония).

Статистически анализ

Промените в метаболитите са изследвани статистически с помощта на t-теста на Welch. За да се направят биологични изводи, използвайки факторно натоварване в анализа на основните компоненти (PCA), факторното натоварване беше определено като коефициент на корелация между резултатите от PC и променливите [22]. Статистическото тестване за факторно натоварване в PCA се извършва въз основа на факта, че за коефициент на корелация r, статистиката:

има t-разпределение със (n − 2) степени на свобода. Метаболити, които имат статистически значими (P Фиг. 1А). Въпреки това, чернодробното тегло нараства леко, но значително при мишки, на които се прилага саке, въпреки че радиацията няма значителни ефекти върху чернодробното тегло (Фигура 1В). Наблюдаваните намаления на теглото на далака при облъчени мишки бяха леко, но значително обърнати от приложението на саке (Фигура 1С). За тимуса, забележимото намаляване на теглото, предизвикано от облъчване, се наблюдава по подобен начин при облъчени мишки, на които се прилага саке (фиг. 1D).

радиационни

Теглото на (A) тялото, (B) черния дроб, (C) далака и (D) тимуса се измерва при събиране на проби от кръв и тъкани. Данните са представени като средни стойности ± S.D. от седем мишки в два независими експеримента. Статистическите анализи бяха извършени чрез несдвоения t-тест.

Анализ на основни компоненти на метаболомични данни

(A) PCA в експеримент за администриране на саке, (B) PCA в експеримент за администриране на 15% етанол. Стойностите на процента, посочени по осите, представляват степента на принос на първия (PC1) и втория (PC2) основни компоненти.

Ефекти на саке върху чернодробния метаболом на облъчени мишки

(A) GMP, (B) UMP, (C) ATP и (D) ADP. Данните са относителни стойности на площта на метаболитите и са представени като средни стойности ± S.D. на трикратни проби. Статистически анализи бяха извършени чрез t-тест на Welch.

Сред седемте избрани метаболити, които са значително модулирани в черния дроб на мишки, лекувани с радиация и саке, GSH е важен регулатор на редокс хомеостазата и GSH/GSSG (глутатион дисулфид) се счита за основната редокс двойка, която определя антиоксидативния капацитет . GSSG е окислената форма на GSH и съотношението GSH/GSSG често се използва като индикатор за клетъчното окислително-редукционно състояние. Тук нивата на GSH и GSSG значително се увеличават и намаляват съответно в черния дроб на мишки, лекувани с комбинация от радиация и саке (Фигура 4). Промените в тези метаболити не са наблюдавани при мишки, на които е приложен 15% етанол вместо саке (фиг. 4), което предполага, че метаболизмът на глутатиона се влияе конкретно от консумацията на саке.

(A) Sake и (B) етанол. Данните са относителни стойности на площта на метаболитите и са представени като средни стойности ± S.D. на трикратни проби. Статистически анализи бяха извършени чрез t-тест на Welch.

Характеризиране на радиационно-индуцирани метаболитни промени в черния дроб

(A) метионин и (B) валин. Данните са относителни стойности на площта на метаболитите и са представени като средни стойности ± S.D. на трикратни проби. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на t-теста на Welch.

Тук метаболитите, които проявяват значително (P Фиг. 6). В този експеримент количеството саке, приложено на мишки, изглежда е прекомерно, тъй като се наблюдава значително увеличение на серумния TG в сравнение с контролните мишки. Въпреки че радиацията сама по себе си индуцира намаляване на нивата на TG, серумното ниво на TG в лекуваната група, която е получила както саке, така и лъчението, е значително намалено до контролното ниво от нивото на мишки, на които е приложено саке. Наблюдаваното намаляване на TG чрез радиация при мишки, на които е приложено саке, може отчасти да се дължи на индукция на антиоксидативни отговори, както е показано от увеличаването на GSH в черния дроб. Съобщава се, че предизвиканото от алкохол натрупване на TG може да бъде смекчено чрез диета, включваща храни, които съдържат фактори, които насърчават антиоксидативните реакции [38].

(A) Глюкоза, (B) общ холестерол (TCHO), (C) лактоза дехидрогеназа (LDH) и (D) триглицериди (TG). Данните са представени като средни стойности ± S.D. от седем мишки в два независими експеримента. Статистическите анализи бяха извършени чрез несдвоения t-тест.

Влияние на приложението на саке върху ефектите на радиацията

Съобщава се, че консумацията на вино смекчава страничните ефекти, свързани с терапиите с радио-рак [39] и че консумацията на бира може да намали неблагоприятните ефекти на радиацията [40]. Необходимо е обаче по-добро разбиране на въздействието на алкохолните напитки върху реакцията на радиация, за да се оцени радиационният риск или медицинските приложения на алкохола. Използван е основан на омик подход за изследване на молекулярни промени в черния дроб на плъхове, лекувани със саке [41]. Такива подходи обаче не са приложени за определяне на специфичните ефекти на саке върху метаболизма на черния дроб спрямо тези на етанола. Доколкото ни е известно, метаболитните анализи не са извършвани от гледна точка на медиацията на стрес към други ефекти на стреса. Саке има антимутагенни ефекти, свойство, което не е приписано на етанола [14], и е доказано, че прилагането на остри дози саке предпазва мишките от неблагоприятните ефекти на облъчване с високи дози по-ефективно, отколкото само етанол [15] ].

маса 1

Аминокиселини Количества (mg) на 100 g саке Аминокиселини Количества (mg) на 100 g саке
Asp3Cys1
Thr2Срещнах се 1.

Въпреки че облъчването и прилагането на саке ясно показаха, че имат интерактивни ефекти по отношение на регулирането на GSH, основният механизъм остава неясен. По-рано демонстрирахме, че затлъстяването медиира радиационната чувствителност [8]. Вредното въздействие на радиацията върху живите организми, особено в случай на лъчение с нисък линеен пренос на енергия (LET), като рентгенови лъчи, се счита за резултат от индуциран от радиация оксидативен стрес. В случай на затлъстяване, индуцираният от затлъстяването оксидативен стрес изглежда медиира ефектите на радиацията в черния дроб. Саке може да повлияе на редокс хомеостазата в черния дроб чрез все още неидентифициран механизъм, което води до промяна на регулацията на GSH след излагане на радиация.

Въпреки че биологичните ефекти от прилагането на алкохол са изследвани в различни експериментални модели [32, 38, 46, 47], в настоящото проучване ние изложихме мишките на алкохол за един месец като експериментален модел. Хроничното приложение на алкохол в продължение на 2 или 6 седмици е използвано за оценка на ефектите на алкохола върху метаболизма при мишки [32, 38, 47] и в съответствие с тези модели, тук също се наблюдава увеличение на TG, което показва, че този модел се разглежда като подходящ модел за оценка на приложението на хроничен алкохол.

За оценката на факторите в механизмите, свързани с чернодробните заболявания, е необходимо да се идентифицират протеините и метаболитите, които се променят при различни условия [48]. Анализът на метаболомите дава представа за основните механизми, които водят до развитие на заболявания, като рак, и може да доведе до идентифициране на потенциални терапевтични цели [49]. В случай на свързано с алкохола заболяване е потвърдена връзка между хроничната консумация на алкохол и затлъстяването на черния дроб [2]. В допълнение, развитието на затлъстяване на черния дроб изглежда се влияе от радиацията [50]. Настоящите констатации, че консумацията на саке смекчава ефектите от радиацията, могат да дадат представа за връзката между свързаните с алкохола заболявания и радиационните ефекти.

Консумацията на алкохол представлява вид калориен прием и се счита, че влияе върху телесното тегло, въпреки че тази връзка е противоречива [57, 58]. Въпреки че крайните телесни тегла на мишките, приемащи етанол или саке, не се различават значително от тези на контролната група (таблици S1 и S2), наблюдават се колебания в телесното тегло по време на периода на приложение. По-конкретно, ясно намаляване на мишките, приемащи 15% етанол или саке, е установено приблизително две до три седмици след началото на периода на приложение. Тъй като през този период се наблюдават намаления прием на храна при мишки, на които е прилаган 15% етанол (таблица S7), наблюдаваните намаления в телесното тегло вероятно са свързани с намален прием на храна. Въпреки че намаляването на приема на храна изглежда се е възстановило в края на периода на приложение, наблюдаваните промени в метаболитите или TG може да са резултат от промени в консумацията на калории след прием на алкохол.

Пиенето на саке в умерени количества има благоприятни и защитни ефекти върху здравето и може да осигури частична защита срещу случайно или медицинско облъчване. Въпреки че количеството на приложение на саке в това проучване не е малко, изглежда, че нивото предизвиква защитни ефекти и е практично за оценка в експериментален модел на мишка [15]. Ако естествените компоненти в саке, които насърчават тези защитни ефекти, са идентифицирани, те могат да допринесат за разбирането на ползите от някои храни за здравето и евентуално да се използват в клиничната обстановка. За тази цел ще е необходима оценка на ефектите от еднократно облъчване върху метаболизма или идентифициране на метаболитни маркери чрез липидомика. Констатациите, представени тук, гарантират по-нататъшно проучване на полезните компоненти, присъстващи в саке, и анализ на метаболитните мрежи, променени от консумацията на саке.

Заключения

Хроничната консумация на японско саке предизвиква специфични метаболитни промени в черния дроб в отговор на облъчване. Въпреки че излишната консумация на саке може да предизвика неблагоприятни ефекти върху черния дроб, приемът на саке има потенциал да насърчи антиоксидативния стрес след радиационно излагане. Констатациите, представени тук, показват, че умерената консумация на саке може да насърчи антиоксидативната активност след излагане на стрес като радиация, като по този начин ограничава неблагоприятните ефекти, типично свързани с тези стресове.