Резюме

Заден план

Затлъстяването при кучета е нарастващ проблем, свързан с заболеваемост, съкратена продължителност на живота и лошо качество на живот. Кучетата с наднормено тегло проявяват хиперлипидемия след хранене, подчертавайки необходимостта от идентифициране на потенциални нарушения в липидния метаболизъм. Това проучване изследва метаболити, свързани с липидния метаболизъм (т.е. ацилкарнитини и таурин) и фосфолипиди в тест за предизвикване на фураж и има за цел да идентифицира метаболитни вариации при кучета със спонтанно наднормено тегло. Включени са двадесет и осем здрави мъжки кучета лабрадор ретривър, 12 от които са класифицирани като слаби (оценка на телесното състояние (BCS) 4–5 по 9-бална скала) и 16 като наднормено тегло (BCS 6–8). След гладуване през нощта (14–17 часа) се вземат кръвни проби на гладно и кучетата се хранят с високо съдържание на мазнини, последвано от събиране на кръвна проба след хранене на час в продължение на 4 часа. За идентифициране на плазмени метаболити и фосфолипиди се използва течна хроматография-време на полетна масова спектрометрия (LC-TOFMS). За интерпретация на данните са използвани многовариантни модели, смесени модели на повтарящи се измервания и линейна регресия.

Резултати

При всички кучета пропионилкарнитин, стеароилкарнитин и девет фосфолипиди се увеличават в отговор на приема на храна, докато ваценилкарнитинът намалява (P ≤ 0,005 за всички). Като цяло, сигналните зони за карнитин и ацетилкарнитин в теста за предизвикване на фураж са по-ниски при кучета с наднормено тегло (P ≤ 0,004). Забележително е, че ацетилкарнитинът на гладно е по-нисък при кучета с наднормено тегло, отколкото при слаби кучета (P = 0,001) и това не се е променило в отговор на храненето. Последната констатация е в контраст с намалената площ на сигнала за ацетилкарнитин, установена при слаби кучета в рамките на един час след хранене (P 6) отколкото при слаби кучета (P

Заден план

Наблюдава се бързо нарастване на броя на хората с наднормено тегло и затлъстяване по целия свят. Затлъстелите хора често страдат от тежки здравословни усложнения и в днешно време затлъстяването се класифицира като болест [1]. Кучетата до голяма степен споделят начина на живот със собствениците си [2, 3], а наднорменото тегло също е нарастващ проблем при кучетата [4, 5], свързан с заболеваемост, лошо качество на живот [6, 7] и по-кратка продължителност на живота [8, 9]. Доказано е, че кучетата с наднормено тегло показват инсулинова резистентност и постпрандиална хипертриглицеридемия [10,11,12] и вариации в метаболитите, свързани с липидния метаболизъм [13,14,15], в сравнение с слабите кучета.

Предполага се, че метаболитната гъвкавост може да бъде връзка между затлъстяването и инсулиновата резистентност [16, 17]. Такава връзка може да присъства и при кучета, резистентни към инсулин. Значението на гъвкавия метаболизъм придобива все по-голямо внимание в изследванията на метаболитното здраве и затлъстяването, тъй като описва скоростта на окисление на митохондриите и капацитета на превключване на горивото [18,19,20]. Карнитинът се счита за важен метаболит в регулирането на метаболитната гъвкавост и в липидния метаболизъм, тъй като той посредничи за вноса на дълго- и средноверижни мастни киселини в митохондриалната матрица за бета-окисление и действа като буфер за ацилни групи чрез образуване на карнитин естери, т.е. ацилкарнитини [17, 21]. При хората ацилкарнитиновите модели, анализирани чрез масспектрометрия, обикновено се използват за скрининг и диагностика на вродени дефекти в липидния метаболизъм [22]. Освен това е доказано, че карнитинът играе роля при усложнен захарен диабет тип 2 при хората [23] и са установени повишени концентрации на ацилкарнитин със средна или дълга верига при затлъстели в сравнение с слаби пациенти [24, 25]. Моделите на ацилкарнитин след прием на храна са изследвани при хора [26], но в момента липсват съответни проучвания при кучета.

При хора с наднормено тегло е доказано, че фракциите на липопротеините са по-високи, отколкото при слабите индивиди, с изключение на липопротеините с висока плътност, които обикновено са с по-ниско затлъстяване [27]. Не е ясно дали всички или специфични липопротеинови фракции се увеличават при кучета с наднормено тегло, тъй като предишни проучвания показват различни резултати [28,29,30,31]. Освен това кучетата имат липопротеинова фракция с висока плътност в сравнение с хората [28]. Фосфолипидите представляват основния компонент на липопротеините при кучета [32] и следователно представляват особен интерес. Липидомиката е аналитичен подход, който може да се използва за характеризиране на модела на фосфолипидите в плазмата [33], но при кучета този подход досега се използва главно при пациенти с остро наднормено тегло [14]. Променените липидни пътища при затлъстели хора, като повишаване на лизофосфатидилхолините, са идентифицирани с липидомика [34]. Следователно е от интерес да се сравнят фосфолипидните профили между слаби и наднормени кучета, като се използва течна хроматография-време на полетна масова спектрометрия (LC-TOFMS) липидомика.

Нашата изходна хипотеза беше, че преди и след приема на храна, метаболитите на ацилкарнитин и потенциално някои фосфолипиди се променят по същия начин при кучета с наднормено тегло, както и при хора с наднормено тегло. Следователно целите на настоящото проучване бяха да се изследват метаболитите, свързани с липидния метаболизъм (т.е. ацилкарнитини и таурин) и фосфолипидите в тест за предизвикване на фураж и да се идентифицират метаболитните вариации, свързани със спонтанното наднормено тегло при кучета.

Методи

Кучета и общ дизайн на обучение

Частните непокътнати мъжки кучета лабрадор ретривър бяха вербувани с лични писма до собствениците на кучета, използвайки регистър, предоставен от Шведския киноложки клуб. Процесът на подбор се състои от онлайн проучване и клиничен здравен преглед (извършен от JS), включващ анализи на кръв и урина, всички, за да се гарантира, че кучетата отговарят на критериите за включване и изключване [35]. В проучването са включени двадесет и осем здрави кучета лабрадор ретривър. В допълнение към здравния преглед, всички кучета са подложени на оценяване на състоянието на тялото (BCS), са претеглени и снимани [35].

Не бяха направени корекции на обичайната домашна диета или лакомства на кучетата преди участие. По време на две седмици, предхождащи проучването, хранителните анамнези се събират от ежедневни хранителни дневници. Според тях всички кучета са имали основното енергийно снабдяване от сухи или мокри пълноценни търговски диети, а най-често срещаният източник на протеини е пилето. Ограничен брой слаби и с наднормено тегло кучета са били хранени с диета с ниско съдържание на мазнини, ограничена с калории, получавали са основната си част от метаболизиращата се енергия от мазнини или са получавали пълноценни диети, съдържащи добавки L-карнитин. Честотите, с които слабите и с наднормено тегло кучета са получили отпадъци от маса, лакомства или дъвчене на кучета, не се различават (Допълнителен файл 1).

Кучетата са гладували от 18:00 ч. В деня преди клиничните проби и сутринта на деня на изследването е била задържана вода и е взета обезценена проба от урина. Между 8 и 9:30 сутринта, след 14–17 часа на гладно, кучетата пристигнаха в клиниката, подложиха се на здравен преглед и бяха взети кръвни проби на гладно. След това се сервира пробно хранене и се вземат кръвни проби след хранене на час четири пъти. Изследването е проведено в Шведския университет по селскостопански науки, Упсала, Швеция и е одобрено от Етичния комитет за експерименти с животни, Упсала, Швеция (C180/12). Това проспективно проучване следва насоки за докладване на наблюдателни проучвания в епидемиологията [36] и за всяко куче е получено писмено съгласие на собственика.

Оценка на телесното състояние

Кръвните проби на гладно се събират чрез венозен катетър 15 минути преди тестовото хранене и след това на час до четири часа след хранене. Подробности относно процедурата за вземане на кръвна проба и събирането на серум са описани по-рано [39]. Плазмени епруветки (Hettich Vacuette литиев хепарин, Greiner bio-one) бяха центрофугирани (1500 ×ж за 10 минути) директно след вземане на проби и плазмата се прехвърля в полипропиленови епруветки (SC Micro Tube PCR-PT, Sarstedt AG & Co, Нюмбрехт, Германия) и веднага се замразява при - 70 ° C.

LC-TOFMS-базиран метаболомичен анализ

приготвяне на пробата

За LC-TOFMS плазмените проби бяха размразени върху лед и 5 μL бяха извлечени в 495 μL метанол (клас LC-MS, VWR Chemicals, Radnor, PA), добавен с фосфолипидни стандарти (Допълнителен файл 4). Протеиновата утайка се отделя чрез центрофугиране при 10000 хж за 10 минути при 4 ° С и 450 μL супернатант се прехвърлят във флакони за хроматография.

LC-TOFMS анализ

Обработка на данни

Данните бяха обработени с помощта на Compass DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonics, Бремен, Германия) и хроматограмите бяха изгладени от един цикъл на гауссово изглаждане с ширина 2 s преди изчисляването на площта. Хроматографският пик на всеки метаболит беше открит, използвайки точната му маса и време на задържане, включително прозорец на масата от ± 0,01 m/z и време на задържане от ± 30 s. За карнитини бяха определени относителни интензитети. За фосфолипидите абсолютните концентрации в плазмата бяха определени спрямо четири различни фосфолипидни вътрешни стандарти, добавени към пробите.

статистически анализи

Метаболити

Въз основа на предишни открития за вариации в липидния метаболизъм при кучета с наднормено тегло [14, 35], беше създаден списък с потенциално интересни метаболити, свързани с липидния метаболизъм (т.е. ацилкарнитини и таурин) (н = 61) и те бяха търсени в плазмата, въз основа на съединения с точна маса, използвайки генерираните LC-TOFMS спектри. Установено е, че шест от целевите метаболити са над границата на количествено определяне (съотношение сигнал/шум; S /н > 10) и са използвани при статистическите анализи (фиг. 1 и допълнителен файл 5). Отговорите на плазмата на тези шест метаболита в теста за предизвикване на фураж бяха оценени чрез анализ на повторен измерване на смесен модел в SAS [41,42,43] с ниво на значимост P Фиг. 1

метаболитна

Фосфолипиди

Наличието на 317 фосфолипиди беше определено в плазмата чрез LC-TOFMS анализ и количествата на тези фосфолипиди бяха определени с помощта на четири фосфолипидни вътрешни стандарта. Фосфолипидите, които имат стойност нула в повече от 50% от наблюденията, бяха изключени. За да се справят с останалите нулеви стойности, всички наблюдения в набора от данни за останалите 118 фосфолипиди (Допълнителен файл 6) са добавили 0,01 nM към измерената концентрация. Използвани са многовариантни статистически данни (SIMCA-P + 13.0 Umetrics, Umeå, Швеция) за идентифициране на фосфолипиди (nM), които варират във времето при теста за предизвикване на фураж или са свързани с наднормено тегло (н = 118 като x-променливи). Приложено е рандомизиране на сурови данни и поетапно премахване на до три отклонения (с помощта на анализ на главните компоненти) при всяко сравнение.

Използван е сдвоен многовариатен модел, ортогонален анализ на проекционен ефект на частични най-малки квадрати (OPLS-EP) за сравняване на всяка точка след хранене с гладно. Този модел сравнява отговорите (тук с концентрацията на гладно, извадена от всяка времева точка след хранене) като x-променливи с целева стойност от y = 1 [40]. Моделът OPLS-EP изразява структурата на данните и може да идентифицира индивиди с отклоняващ се метаболитен отговор на интервенция, тук тестът за предизвикване на фураж. Четири OPLS-EP модела са конструирани с използване на единично мащабиране на дисперсията (UVN) за x-променливи и без мащабиране за y-променлива, както се препоръчва от създателите на модела [40]. Значимостта на OPLS-EP моделите е проверена с помощта на кръстосано валидиран дисперсионен анализ (CV-ANOVA) [44], където стойност на P 1.5 и за които съответните 95% доверителни интервали на базата на ножове (CI) не са близки до или включително нула се считат за дискриминационни и значими за наблюдаваните раздели. Фосфолипидите със значителни ВИП бяха тествани със смесен модел на повторен анализ на мерките, както е описано по-горе. След корекция на Bonferroni за множество сравнения, нивото на значимост е α

Резултати

Метаболити

Фосфолипидни отговори на приема на храна. Променлива важност на проекционните (VIP) стойности, базирани на анализ на проекция на ефект на ортогонални частични ефекти на най-малките квадрати (OPLS-EP) (4-часова точка минус гладуване) на набора от данни за фосфолипидите. Стойностите се показват като VIP и доверителен интервал (CI). Показват се дискриминантни фосфолипиди, добавящи значителна структура към модела (VIP> 1,5) и за които съответните 95% CI, базирани на крик нож, не са близо или включват нула.

Мултивариантните OPLS-DA модели във всеки отделен момент от време не идентифицират никаква многовариантна разлика във фосфолипидните профили между слаби и наднормено тегло кучета. Задвижваните от хипотезата анализи на линейна регресия показват положителна връзка между един фосфатидилхолин на гладно (PCaa C38: 4) и BCS (R 2 0.31 и P = 0,002). Въпреки че линейният регресионен анализ беше значителен, графикът не показа разлики в концентрациите на PCaa C38: 4 между слаби (BCS 4-5) и леко наднормено тегло кучета (BCS 6). За да се проучи това допълнително, кучетата бяха разделени на групи слаби (BCS 4-5, n = 12), леко наднормено тегло (BCS 6, н = 10) и видни кучета с наднормено тегло (BCS> 6, н = 6) за това сравнение е използвана еднопосочна ANOVA с регулиране на Tukey-Kramer. Кучетата с наднормено тегло (BCS> 6) са имали значително по-висока концентрация на PCaa C38: 4 (P Фиг. 4

Дискусия

В това проучване е установен модел на ацетилкарнитин, показващ метаболитна гъвкавост към приема на храна при кучета със спонтанно наднормено тегло лабрадор ретривър, въпреки че нито едно от кучетата с наднормено тегло не показва признаци на дълбока инсулинова резистентност [39]. Установено е, че общите сигнални зони на карнитин са по-ниски при кучета с наднормено тегло, отколкото при слаби кучета. Интересното е, че по-ниският статус на карнитин теоретично може да забави окисляването на мастните киселини, тъй като карнитинът транспортира мастни киселини вътре в митохондриите за бета окисление [46].

В допълнение, слабите кучета от настоящото проучване показват значително намалена площ на сигнала за ацетилкарнитин от гладно до един час след прием на храна, докато кучетата с наднормено тегло не показват отговор на хранене. Тези открития показват гъвкав метаболизъм при слаби кучета, който не се наблюдава при кучета с наднормено тегло. Намалената зона за прием на ацетилкарнитин след хранене при слаби кучета може да представлява превключване на горивото от използване на ендогенно съхранявани липиди към използване на наскоро абсорбирана глюкоза от тестовото хранене, както беше показано по-рано при хора [26]. По този начин преходът от катаболно към анаболно състояние е очевиден при слаби, но не и при кучета с наднормено тегло. Слаби (BCS 4-5) и леко наднормено тегло кучета (BCS 6) показват сравними концентрации на лептин (Допълнителен файл 2). Въпреки това, признаци на метаболитна гъвкавост са налице вече при кучета с малко наднормено тегло (BCS 6), както е показано от отговора им на ацетилкарнитин (Допълнителен файл 2). Интересното е, че отговорът на ацетилкарнитин не се различава между леко наднормено тегло (BCS 6) и видно наднормено тегло кучета (BCS> 6), което показва сравнима метаболитна гъвкавост спрямо приема на храна в тези две групи. Тези открития предполагат, че метаболитната гъвкавост при кучета може да бъде повлияна от други фактори, а не само от затлъстяване (Допълнителен файл 7).

Въпреки големите усилия най-накрая може да бъде включен относително малък брой кучета. Въпреки това, сдвоените многовариантни модели и смесените модели на многократни анализи на измервания, използвани в настоящото проучване, се оказаха стабилни и успяха да открият ясни отговори с течение на времето и групови разлики в теста за предизвикване на фураж. Би било желателно да се включат повече затлъстели (BCS 8–9), но все пак здрави кучета, но такива кучета се оказаха изключително трудни за записване. Обективно потвърждение (например рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия) на клинично оценената BCS може да е засилило резултатите от BCS, но този метод не е бил наличен по време на проучването. Фактът, че в това проучване са използвани само кучета от една порода и пол, вероятно е намалил индивидуалните вариации и е направил възможно откриването на фини метаболитни вариации въпреки относително малък размер на пробата. За по-нататъшно изследване на концепцията за метаболитна гъвкавост при кучешко наднормено тегло са необходими изследвания върху по-големи кохорти от различни породи и по-голямо разнообразие от оценки на телесното състояние. Освен това е необходимо да се проучат възможните ефекти от различни режими на хранене на фона и да се оправдаят проучванията за окисляване на субстрата.

Заключения

Това проучване върху спонтанно наднормено тегло здрави лабрадор ретривъри показа, че дори умерено наднормено тегло при кучета може да повлияе на параметрите на липидния метаболизъм. Кучетата с наднормено тегло показват цялостен компрометиран карнитинов статус, представляващ потенциална карнитинова недостатъчност. Отговорът на ацетилкарнитин при кучета с наднормено тегло показва намалено окисление на мастните киселини на гладно и метаболитна неточност към приема на храна. Оправдани са по-нататъшни проучвания върху метаболитната гъвкавост и нейната потенциална роля в метаболизма на кучета с наднормено тегло.