Резюме

Пациентите с диабет са с два до шест пъти по-голям риск от развитие на атеросклероза, отколкото недиабетните индивиди (1,2), а най-честата причина за смърт при възрастни пациенти с диабет е коронарната болест на сърцето (3). Този излишен риск се среща както при диабет тип 1, така и при тип 2 (3). За разлика от недиабетните пациенти, сърдечните заболявания при пациенти с диабет се появяват по-рано в живота, засягат жените почти толкова често, колкото мъжете, и са по-често фатални (3). До 80% от всички пациенти с диабет тип 2 ще умрат от атеросклеротична макроваскуларна болест (4), а възрастните пациенти с диабет са по-податливи на развитие на други атеросклеротични рискови фактори, включително хипертония и дислипидемии (3). Освен това данните за ефикасността на инсулиновия контрол на диабета при подобряване на атеросклеротичната болест са противоречиви. Въпреки че подобряването на гликемичния контрол може да намали риска от сърдечни заболявания при пациенти с диабет тип 1 (3), лекуваните с инсулин пациенти с диабет тип 2 продължават да имат повишен риск от сърдечно-съдови събития (3).

ускорена

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Индукция на хиперлипемия и диабет.

Всички процедури, включващи животни, бяха одобрени от Комитета за използване на животни в научните изследвания и образованието на Медицинския колеж в Джорджия и бяха съобразени с тези, одобрени от Американската ветеринарномедицинска асоциация по евтаназия.

Събиране на тъкани и моноцити.

Ефект на STZ върху β-клетките.

За да се изследва ефектът от инжектирането на STZ върху β-клетките, произвеждащи инсулин, проби от панкреаса се фиксират във формалин, вграждат се в парафин, секат се и се оцветяват с антитяло срещу свински инсулин. Използвайки стандартно увеличение, процентната площ на панкреаса в секцията, заета от клетки, произвеждащи инсулин, беше измерена във всичките четири групи свине, използвайки компютъризиран анализ на изображения на 2, 8 и 20 седмици след инжектиране на STZ.

Изолиране на кръвни моноцити и липиден анализ.

Точно преди аутопсията, 400 ml кръв бяха отстранени в хепаринизирани спринцовки чрез югуларен катетър. Моноцитите се изолират чрез противотоково центрофугиране, както е описано по-рано (14). Прясно изолирани моноцити с> 95% чистота бяха инкубирани (1,5–2 × 106 клетки/ml) при 37 ° C в продължение на 90 минути в 2,0 ml смес от Medium 199 (Life Technologies, Grand Island, NY) и нормална свиня плазма (1: 1, обем/обем), който съдържа или [1- 14 С] -ацетат или [1- 14 С] -олеат на нива от 2 или 3 μCi/ml (специфична активност: 58.0 и 57.0 Ci/mol, съответно) (NEN Research Products, Бостън, Масачузетс). След инкубация клетките се утаяват чрез центрофугиране, изплакват се с балансиран солев разтвор на Hanks с Ca 2+ и Mg 2+ (Whitacker Products, Walkerville, MD) и след това се екстрахират със смеси хлороформ/метанол (24). Липидните екстракти се фракционират чрез тънкослойна хроматография върху G-покрити със стъклени пластини със силикагел, като се използва разтворителна система от N-хексан/диетилов етер/ледена оцетна киселина, 146: 50: 4 (обем: обем: обем) (20) . Липидните ленти се изстъргват във флакони и се анализират директно за радиоактивност чрез течно сцинтилационно броене (25).

В случай на инкубации с [1- 14 С] ацетат, част от липидните екстракти се добавят със 100 μg холестерол-носител и след това се осапунват и се определя общата радиоактивност в дигитонин-преципитируеми стероли (26). Пробите от прясно изолирани моноцити също бяха директно извлечени, както по-горе (24), а липидните екстракти бяха фракционирани чрез високоефективна течна хроматография (27) за целите на определяне на ендогенната липидна маса на клетките.

Анализ на артериална тъкан и липиди.

Пробите от различните артериални легла веднага се изплакват в охладен с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се отварят надлъжно, а препаратите от интима медия се отстраняват внимателно от подлежащата среда и адвентиция, докато се гледат под дисекционен микроскоп. Тъканите се инкубират при 37 ° С в продължение на 90 минути в 9,0 ml от средата 199/нормална плазмена среда на свине, описана по-горе, съдържаща 1,5 μCi/ml [1- 14 C] -олеат (специфична активност: 57,0 Ci/mol) (NEN Изследователски продукти). След инкубация тъканите се изплакват в PBS и се екстрахират чрез хомогенизиране в смеси хлороформ/метанол, както е описано по-рано (15). Една порция от липидния екстракт се фракционира чрез тънкослойна хроматография, както е описано по-горе, докато втора порция се осапунява и общото съдържание на холестерол се определя след утаяване на стерилите с дигитонин (26).

РЕЗУЛТАТИ

Плазмени нива на глюкоза и липиди.

Ефект на STZ върху β-клетките.

Всички свине, инжектирани със STZ, показват пикова плазмена глюкоза на гладно в рамките на 2 дни след третата инжекция. След това по-голямата част от свинете показват лек спад в нивото на глюкозата, но поддържат нива на диабет> 11 mmol/l (фиг. 1). Изследването на участъци от панкреаса, имунооцветени със свински анти-инсулинови антитела, показва, че контролните (N) свине (n = 10) съдържат 221 ± 86 β-клетки, произвеждащи инсулин на стандартизирано поле, в сравнение с 23 ± 4 β-клетки за 2 седмици (n = 10 свине) след инжектиране на STZ и 43 ± 10 β-клетки на поле на 20 седмици (n = 10 свине) след инжектиране (Фиг. 4А-С). Клетките, произвеждащи инсулин при контролни животни, са очевидно предимно групирани в островчета (фиг. 4А), докато на 2 седмици след инжектирането на STZ единични β-клетки са разпръснати, без данни за групиране (фиг. 4В). До 8–20 седмици след инжектирането на STZ е очевидна регенерация на β-клетки и въпреки че плътността на β-клетките е значително намалена в сравнение с контролите (фиг. 4А), се наблюдава известно групиране на клетки, произвеждащи инсулин в островчета допълнение към единични клетки (фиг. 4С).

Липидни изследвания.

Съдържанието на холестерол и образуването на холестерилов естер са измерени в стандартизирани сегменти на аорта, илиачна и каротидна артерии от 20-седмични свине (n = 10/група). Моделите, наблюдавани в илиачните и каротидните артерии и в лезиочувствителните и нечувствителните области на аортната дъга, са подобни на тези, наблюдавани в гръдната аорта и данните от тези сегменти на съдовете не са показани. В аортата самият диабет няма ефект върху съдържанието на холестерол при нормолипемични условия (Фиг. 5А и В). Само хиперлипемия повишава съдържанието на артериален холестерол от два до шест пъти над контролните съдове, дори в силно нелезирани области на гръдна и коремна аорта при свине с N-HL (фигури 5А и В). Коремните лезии са имали 10 пъти по-високо съдържание на холестерол в сравнение с нелезирани участъци от същата свиня N-HL, дори при липса на диабет (фиг. 5В и С). Въпреки това, въпреки че наслагването на диабет не е увеличило значително съдържанието на холестерол в грубо нелезирани области на коремната аорта (фиг. 5В), съдържанието в увредените зони е двойно по-голямо от наблюдаваното само при хиперлипемия (фиг. 5С).

Синтезът на холестерилов естер от [14 С] -олеат, който се разглежда като ранен биохимичен индекс на скоростта на атерогенезата, се увеличава 3 до 20 пъти във всички грубо нормални артериални легла само чрез хиперлипемия (Таблица 1). Въпреки това, наслагването на диабет върху хиперлипемия удвоява включването на олеат в сравнение с хиперлипемия самостоятелно както в гръдния, така и в нелезирания коремен сегмент (Таблица 1). След установяване на лезии обаче не се забелязват разлики между недиабетните и диабетичните хиперлипемични животни (Таблица 1), което предполага, че е достигната максимална степен на включване.

Синтез от моноцити.

Тъй като по-рано демонстрирахме, че получените от моноцити макрофаги са основният клетъчен тип, присъстващ в интимата в ранните лезии (8,9,15) и че циркулиращите моноцити имат подобрена липидна биосинтеза, активност на ацил-CoA-холестерол ацилтрансфераза (ACAT) и холестерол естерификация при хиперлипемични животни (15), изследвахме липогенезата от [14 С] -ацетат и [14 С] -олеат в моноцити от четирите групи свине на 20 седмици. Липогенезата от [14 С] -ацетат се подобрява до 40% над контрола само чрез хиперлипемия във всички липидни класове (Фиг. 6А). При липса на хиперлипемия, диабетът имаше малък или никакъв ефект върху липогенезата. Въпреки това, когато се наслагва върху хиперлипемия, диабетът допълнително увеличава синтеза във всички класове над този, наблюдаван само при хиперлипемия (Фиг. 6А). Освен това, активността на ACAT в моноцити, измерена чрез включване на [14 C] -олеат в холестерилови естери (фиг. 6В), реагира както на диабета (40% увеличение над контрола), така и само на хиперлипемия (трикратно над контрола) и комбинацията от двамата допълнително увеличиха този отговор на четирикратни над контролите, констатации, които са в съответствие с тези, наблюдавани в нелезирани зони в стената на съда (Таблица 1).

Ускорена атеросклероза при диабетни свине.

Този модел на хиперлипемична диабетна свиня се характеризира със силно ускорена атеросклероза в диабетно състояние. Както се очакваше, само хиперлипемични животни са развили лезии. Тези разлики се визуализират качествено на аортите, оцветени в Судан IV, гледани грубо, както на фиг. 7: панели A и B са гръдна и коремна аорта от представително 20-седмично D-HL животно; панели C и D показват тези от N-HL животно на същия етап със сравними крайни нива на холестерол (15,2 срещу 14,7 mmol/l). Компютъризиран анализ на изображения на аорти, оцветени в Судан и от четирите групи (Фиг. 8), показва, че процентът на аортната повърхност, засегната от лезия, е средно два пъти по-голям при D-HL в сравнение с N-HL свине, дори още на 12 седмици. При продължителни (48 седмици) хиперлипемични състояния ефектът на диабета е по-слабо изразен, тъй като покритието на лезиите се увеличава максимално.