Резюме

  • ATM, макрофаг, пребиваващ в мастната тъкан
  • LDLR, LDL рецептор
  • MCP-1, моноцитен хемоаттрактант протеин-1
  • MIP-1α, макрофаги възпалителен протеин-1α
  • NEFA, нестерифицирана мастна киселина
  • ЯМР, ядрено-магнитен резонанс
  • RIA, радиоимуноанализ
  • SAA, серумен амилоид А
  • TBO, толуидиново синьо O
  • TNF-α, фактор на туморна некроза-α
  • VDDRC, Изследователски център за храносмилателни заболявания на Vanderbilt
  • WAT, бяла мастна тъкан

Затлъстяването е основна грижа за здравето поради връзката му с други патологични състояния, свързани с метаболитния синдром. Някои от рисковите фактори, свързани със затлъстяването, включват дислипидемия, провъзпалително състояние, хипертония и инсулинова резистентност (1,2). Дислипидемията, наблюдавана при затлъстяване, се характеризира с повишени нива на нестерифицирани мастни киселини (NEFA), триглицериди и малки плътни LDL частици, заедно с намалени нива на HDL (1–3). Отделните компоненти на метаболитния синдром са независими рискови фактори за диабет и сърдечно-съдови заболявания; когато обаче тези елементи са едновременни, те имат адитивни или дори синергични ефекти (2). Всъщност хората с фамилна комбинирана хиперлипидемия са по-устойчиви на инсулин в сравнение с нормолипидемични роднини, дори след корекция за ИТМ (4). Нещо повече, чувствителността към инсулин е значително по-ниска при пациенти със затлъстяване с хиперлипидемия в сравнение с пациенти с хиперлипидемия, които не са с дебелина (5). Следователно наличието както на затлъстяване, така и на хиперлипидемия може да окаже адитивен ефект върху инсулиновата резистентност.

липиди

Последните проучвания са изследвали различни форми на затлъстяване и са установили повишени нива на макрофаги в бяла мастна тъкан (WAT) на затлъстели гризачи и хора в сравнение с слабите контроли (6-13). В допълнение, многобройни проучвания са установили, че макрофагите, пребиваващи в мастната тъкан (ATM), са отговорни за голяма част от производството на възпалителни цитокини в WAT в състояние на затлъстяване (8,10,14,15). Освен това е показано, че инфилтрацията на макрофаги в WAT предшества или е съвпадна с инсулиновата резистентност при затлъстели мишки (10). Доказано е, че загубата на тегло води до намаляване на натрупването на АТМ и подобряване на възпалителния статус при хората, затвърждавайки връзката на затлъстяването с инфилтрацията на макрофаги в WAT (6,12,16). В допълнение, лечението на инсулинорезистентни хора с инсулин-сенсибилизиращ пероксизомен пролифератор-активиран рецептор γ агонист, пиоглитазон, за подобряване на инсулиновата чувствителност също намалява натрупването на ATM (13). По този начин банкоматите играят ключова роля в патофизиологичните състояния, свързани със затлъстяването и метаболитния синдром.

Въпреки че изследванията върху инфилтрацията на макрофаги в WAT са видни понастоящем, потенциалните ефекти на други компоненти на метаболитния синдром, като хиперлипидемия, върху съдържанието на ATM в затлъстяване все още трябва да бъдат изяснени. Хипертриглицеридемията на гладно често се свързва с повишено висцерално затлъстяване, свързващо хиперлипидемия с аномалии, свързани със затлъстяването (17,18). Плазмените нива на триглицеридите са независимо свързани с възпалението и могат да се увеличат по време на остра инфекция или при излагане на множество възпалителни цитокини (19). Освен това е доказано, че фармацевтичното понижаване на плазмените нива на липидите със статини намалява плазмените възпалителни нива на цитокини (20). И накрая, скорошен доклад на Cancello et al. (7) демонстрира силна положителна корелация между ATM броя и плазмените нива на триглицеридите и отрицателна корелация с HDL холестерол при затлъстели хора. Тези наблюдения ни доведоха до хипотезата, че хиперлипидемията може също да насърчи инфилтрация на макрофаги в WAT в състояние на затлъстяване и че част от връзката между възпалението и хиперлипидемията може да се отдаде на увеличеното натрупване на ATM.

За да тестваме тази хипотеза, използвахме поредица от модели на мишки с нарастващо затлъстяване и хиперлипидемия, за да определим приноса на хиперлипидемията към натрупването на АТМ. Анализът на тези мишки разкрива, че инфилтрацията на макрофаги е свързана със степента на затлъстяване; тези ефекти обаче не зависят от степента на хиперлипидемия. Тези данни показват, че хиперлипидемията не увеличава набирането на макрофаги в WAT при затлъстяване в тази моделна система. В допълнение, нашите данни подчертават факта, че прекомерният прием на мазнини с храната може да стимулира дисфункция на мастната тъкан, което води до локално и системно възпаление, както и до хиперинсулинемия и намалени нива на адипонектин, независимо от нивата на липидите в плазмата.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Мишки и диети.

Мишките, използвани в тези проучвания, са закупени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) и са на фон C57BL/6. Подобно на мишки от див тип, LDL рецепторите (LDLR) -/- мишките са податливи на индуцирано от диета затлъстяване и инсулинова резистентност. В допълнение, те също развиват хиперлипидемия (21,22), което ги прави полезен модел, в който да се изследват физиологичните последици от комбинираното затлъстяване и хиперлипидемия. Мишките A y/a; LDLR -/- бяха произведени чрез кръстосване на склонни към затлъстяване жълти мишки от аготи (A y/a) с LDLR -/- мишки. Мишките се хранят ad libitum и им се предоставя свободен достъп до вода. Западната диета е закупена от Harlan-Teklad (TD88137) и е настроена на калорийна плътност от 4,8 kcal/g с 42% от калориите от източник на мазнини безводна млечна мазнина и 0,15% добавен холестерол. Всички грижи за животните и експериментални процедури са извършени с одобрение от и в съответствие с разпоредбите на Институционалната комисия за грижи и употреба на животните на Университета Вандербилт.

Състав на тялото.

Общата чиста тъканна маса, мазнини и свободна течност бяха определени чрез ядрено-магнитен резонанс (NMR) с помощта на Minispec (Bruker, The Woodlands, TX) в Центъра за метаболитно фенотипиране на мишки в университета Вандербилт.

Събиране и измерване на плазмата.

Мишките са гладували в продължение на 5 часа преди всички вземания на кръв и когато са били убити. На мишките се отделя кръв от ретро-орбиталния венозен плексус, като се използват хепаринизирани капилярни епруветки за събиране. Плазмата се отделя чрез центрофугиране, разпределя се в аликвотни части и се съхранява при -80 ° С. На всички проби бяха направени анализи на липиди и глюкоза (таблици 1 и 2). Общите нива на холестерол и триглицериди в плазмата са измерени с помощта на ензимни комплекти от Raichem (Сан Диего, Калифорния) в съответствие с инструкциите на производителя. Измерванията на NEFA бяха извършени с помощта на NEFA-C комплект от Wako (Neuss, Германия). Нивата на глюкозата се определят с помощта на глюкометър LiTesch OneTouch (Johnson and Johnson, Northridge, CA). Измерванията на инсулин и лептин бяха извършени върху проби с достатъчни обеми, използвайки радиоимуноанализи (RIA). Анализите на серумен амилоид А (SAA) се провеждат чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ, използвайки поликлонално антитяло от R&D Systems (Минеаполис, MN) срещу рекомбинантен миши SAA1 (разреждане 1: 2000). Използвано е вторично анти-козе антитяло при разреждане 1: 4000 (23).

Измерване на адипонектин.

Плазмените проби се електрофорезират чрез неденатурирани, нередуцирани 4-12% SDS гелове. Протеинът се прехвърля в нитроцелулозни мембрани и се сондира със заешки антимиши адипонектин (ABCAM, Кеймбридж, МА) при разреждане 1: 2000. Вторичното антитяло се използва при разреждане 1: 5000 и сигнал се открива с помощта на ECL реагенти (Amersham, Великобритания). Лентите са количествено определени с помощта на софтуера Quantity One (Bio-Rad).

Хистохимия на мастната тъкан.

Изрязаната коремна WAT се съхранява в 10% формалин и след това се влага в парафин. Парафиновите секции бяха фиксирани и оцветени с толуидин синьо O (TBO) в съответствие с инструкциите на производителя (Newcomer Supply, Middleton, WI). Имунохистохимичното оцветяване за F4/80 се извършва с антитяло от Serotec (Raleigh, NC) при разреждане 1: 100. Вторичното антитяло (Dako, Glostrup, Дания) се използва при разреждане 1: 100.

Генната експресия.

РНК се изолира от висцерален WAT с помощта на RNeasy Mini комплект (Qiagen, Валенсия, Калифорния), съгласно инструкциите на производителя. Количествената RT-PCR в реално време се извършва, използвайки системата за откриване на последователност ABI Prism7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Набори от сонда за грунд (Assays-on-Demand) са закупени от Applied Biosystems. Експресията на гени се сравнява с 18S контроли, използвайки ΔΔCT метода, както е описано по-горе (24). За да се елиминира възможността за вариабилност между плочите, всичките шест групи бяха амплифицирани на една плака за всеки ген (ограничаване на броя на пробите от всяка група).

Статистика.

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism 4 (Сан Диего, Калифорния) и JMP софтуера от SAS (Cary, NC). Данните са изразени като средни стойности ± SE и се считат за значими при P -/- мишки.

За да се определи дали хиперлипидемията допринася за инфилтрацията на макрофаги в WAT при затлъстяване, бяха използвани генетични и диетични манипулации. Склонни към затлъстяване мишки, повсеместно и ектопично експресиращи протеина агути (A y/a), бяха кръстосани с мишки, склонни към хиперлипидемия LDLR-дефицитни (LDLR -/-). На 4-месечна възраст, мъжки A y/a; LDLR -/- мишки и техните контролни (a/a) събирачи, a/a; LDLR -/-, или се поддържат на чау диета, или се хранят с високо съдържание на мазнини, западна диета за 12 седмици. Получените четири експериментални групи бяха, както следва: 1) a/a; LDLR -/- мишки на чау диета, 2) A y/a; LDLR -/- мишки на чау диета, 3) a/a; LDLR -/- мишки на западна диета и 4) A y/a; LDLR -/- мишки на западна диета.

В края на диетата се измерва телесно тегло, обща телесна мазнина, общ плазмен холестерол, плазмени триглицериди и NEFA (Таблица 1). Във всеки случай мишките A y/a са по-тежки от техните a/a контроли, а западните мишки, хранени с диета, са по-тежки от техните контроли, хранени с диета. Това доведе до постепенно увеличаване на телесното тегло, преминавайки от a/a; LDLR -/- чау диетични мишки до A y/a; LDLR -/- мишки от Западна диета. Увеличаването на наддаването на тегло се дължи на увеличаване на общите телесни мазнини, мярка за затлъстяване, както се определя от NMR анализ.

Качествен и количествен анализ на маркери на макрофаги в WAT.

Въз основа на изображенията на TBO, се оказа, че групата A y/a; LDLR -/- Западна диета има значително по-голямо съдържание на ATM от останалите групи, което предполага, че хиперлипидемията може да увеличи инфилтрацията на макрофаги във WAT. Тези мишки обаче също са били по-затлъстели от останалите групи. По този начин бяха добавени две допълнителни групи: 1) a/a; LDLR +/+ мишки, хранени със западна диета; и 2) A y/a; LDLR +/+ мишки, хранени със западна диета. Телесното тегло и общите телесни мазнини са малко по-високи в западните диети, хранени с LDLR +/+ групи в сравнение със западните диети, хранени с LDLR -/- групи; обаче плазмените нива на липидите не са били повишени от западното диетично хранене поради наличието на LDLR (Таблица 2).

След TBO оцветяване на WAT от първоначалните четири групи, беше извършена по-специфична имунохистохимична характеристика на коремната WAT от всичките шест групи, използвайки антитяло към повърхностния маркер на макрофага F4/80 (фиг. 2A-L). Подобни морфологични разлики и степен на инфилтрация на макрофаги са открити при A y/a; LDLR +/+ Western диетични мишки, както е отбелязано в A y/a; LDLR -/- Western диета (Фиг. 2, сравнете F и L с E и K).

Коремната WAT от всичките шест групи също се събира за оценка на генната експресия на маркери на макрофаги F4/80 и CD68, използвайки количествена RT-PCR. Отразявайки постепенното нарастване на телесното тегло и общите телесни мазнини (таблици 1 и 2), се наблюдава постепенно увеличение на експресията на F4/80 и CD68 (фиг. 2M и N).

Поради малко по-високото телесно тегло и затлъстяване при западните диети, хранени с LDLR +/+ мишки в сравнение с мишките LDLR -/-, подгрупи мишки бяха избрани въз основа на общата им телесна мастна маса, така че да няма значителни разлики в означава общата маса на телесните мазнини между всяка подгрупа. Средната маса на телесните мазнини при умерено затлъстялата хиперлипидемия a/a; LDLR -/- групата на Западна диета беше съпоставена с нормолипидемичната a/a; LDLR +/+ Западна диетична група. По същия начин средната маса на телесните мазнини при тежко затлъстялата хиперлипидемия A y/a; LDLR -/- западната диетична група беше съпоставена с нормолипидемичната A y/a; LDLR +/+ западна диетична група (Фиг. 3A и B; a/a; LDLR -/- диета с чау и A y/a; LDLR -/- диета с чау е включена за справка). Чрез контролиране на затлъстяването може да се определи специфичният принос на хиперлипидемията към натрупването на АТМ в условия на умерено и тежко затлъстяване. Оценката на експресията на F4/80 и CD68 в групи, съвпадащи с адипозност, разкрива, че хиперлипидемията не увеличава натрупването на ATM в LDLR -/- мишките в сравнение с техните нормолипидемични LDLR +/+ контроли (Фиг. 3С и D). В действителност, експресията на F4/80 е била повишена в нормолипидемичната A y/a; LDLR +/+ западна диетична група в сравнение с хиперлипидемичната A y/a; LDLR -/- западна диетична група (Фиг. 3C).

Корелация на съдържанието на ATM с плазмените нива на липидите.

ДИСКУСИЯ

В тази моделна система, силно затлъстелите мишки очевидно са имали повече макрофаги в WAT, отколкото средно затлъстелите мишки, но силната корелация между затлъстяването и натрупването на ATM, наблюдавана при умерено затлъстяване, не е налице. Тези данни предполагат, че няма горна граница в степента, до която макрофагите могат да се натрупват в WAT; обаче факторите, допринасящи за натрупването им, могат да се различават в зависимост от степента на затлъстяване. Вероятно ранното набиране на макрофаги, наблюдавано при умерено затлъстяване, се задвижва от адипоцитите, оттук и силната връзка между ATM и затлъстяването. В действителност, непубликувани данни от нашата лаборатория показват, че адипокин лептинът е мощен моноцитен хемоаттрактант. За разлика от това, прекомерното увеличение на банкоматите при силно затлъстели мишки, в сравнение с увеличаването на затлъстяването, предполага, че самите макрофаги се превръщат в диктуващ фактор при разпространението на набирането на допълнителни макрофаги.

Също така забелязахме, че моделът на локално и системно възпаление отразява степента на инфилтрация на макрофаги в WAT по-близо от нивата на липидите в плазмата. Предишни проучвания показват, че банкоматите секретират по-голямата част от възпалителните цитокини, открити в WAT (8,10,14,36). В нашата западна диета, хранени с A y/a; LDLR -/- и A y/a; LDLR +/+ животни, открихме драстично увеличение на експресията на TNF-α, MCP-1, MIP-1α и SAA3. В действителност, експресията на иРНК на хемокини MCP-1 и MIP-1α е била най-малко 11- и 18-кратно повишена, съответно, в WAT от тези групи в сравнение с постно a/a; LDLR -/- чау диета група. Нивото на генна експресия на реагента SAA3 с остра фаза е повишено най-малко 64 пъти при силно затлъстелите мишки. Тези данни са в съответствие с идеята, че банкоматите изпращат сигнали за бедствие, като по този начин усилват набирането на макрофаги в WAT. Експресията на свързания с възпалението рецептор TLR4 също се увеличава в WAT от западните диети, хранени с мишки. Заедно тези данни осигуряват доказателство, че западните мишки, хранени с диета, са в повишено състояние на възпаление, както чрез освобождаване, така и възприемане на възпалителни стимули. Значението на WAT възпалителния статус се отнася до неговите разнообразни ефекти надолу по веригата, като инсулинова резистентност.

Натрупването на макрофаги в WAT е тясно свързано с инсулинова резистентност и води до въпроса дали инфилтрацията на макрофаги в WAT предшества инсулиновата резистентност или инсулиновата резистентност предшества натрупването на ATM. Xu et al. (10) демонстрира, че наличието на макрофаги в WAT временно предшества развитието на хиперинсулинемия при мишки. Обратно, Di Gregorio et al. (13) показват, че лечението с тиазолидиндион на инсулинова резистентност при хора води до намалена инфилтрация на макрофаги в WAT. По този начин натрупването на макрофаги в WAT може да насърчи инсулиновата резистентност, а инсулиновата резистентност след това може да влоши инфилтрацията на макрофагите, създавайки порочен кръг. Затлъстелите мишки в нашите проучвания показват загуба на защита срещу инсулинова резистентност, което се доказва от намалените нива на адипонектин (фиг. 6D). В допълнение, плазмените нива на инсулин (фиг. 6В) се увеличават по начин, който отразява съдържанието на АТМ (фиг. 2М и N). Заедно тези данни осигуряват подкрепа за връзката между инсулиновата резистентност и инфилтрацията на макрофаги в WAT.

Въздействието на диетичните манипулации в този модел мишка не трябва да се пренебрегва. Източникът на мазнини от западната диета, използван в това проучване, се състои от 69% наситени мастни киселини, 27% мононенаситени мастни киселини и 4% полиненаситени мастни киселини. Традиционно е известно, че наситените мастни киселини имат вредни ефекти върху здравето, но напоследък те са специално замесени в активирането на TLR4, което води до експресията на възпалителни генни продукти (38,39). Не само наситените мастни киселини могат да активират TLR4, но полиненаситените мастни киселини могат да възпрепятстват активирането на TLR4 (39,40). Интересното е, че експресията на TLR4 е по-тясно свързана с диетата с високо съдържание на мазнини, отколкото с наднорменото тегло (Фиг. 5С). По време на подготовката на този ръкопис, Flier и колеги (41) демонстрираха ключова роля за натрупването на TLR4 до ATM при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини. По този начин е възможно TLR4, присъстващ на банкомати, да се активира от увеличаване на потока на наситени мастни киселини в западните диети, хранени с мишки.

Нашите данни сочат, че хиперлипидемията не допринася за натрупването на ATM, затруднено от затлъстяване, и неговите патофизиологични последици надолу по веригата, като възпаление и инсулинова резистентност. Тези данни може да имат важни последици за патогенезата на индуцираното от диетата затлъстяване, дори когато липсват аномалии на плазмените липиди.