1 Колеж по бионауки и биотехнологии, Аграрен университет Хунан, Чангша, Хунан 410128, Китай

добавка

2 Ключова лаборатория за агроекологични процеси в субтропичния регион, Институт по субтропично земеделие, Китайска академия на науките, Провинциален изследователски център за здравословно животновъдство в провинция Хунан, Научна наблюдателна и експериментална станция по хранене на животните и фуражна наука в Централна Южна, Министерство на земеделието, Хунан Център за съвместна иновация за безопасност на животинската продукция, Хунан 410125, Китай

3 Институт по животновъдни и ветеринарни науки в Хунан, Чанша, Чанша 410131, Китай

4 Катедра по ботаника и микробиология, Addiriyah Катедра за екологични изследвания, Колеж по наука, Университет King Saud, P.O. Кутия. 2455, Рияд 11451, Саудитска Арабия

Резюме

C57BL/6 мишки бяха тествани с цел да се изследват ефектите на хранителните добавки с хитозан (COS) върху чревната микрофлора и устойчивостта на Citrobacter rodentium инфекция. Констатациите разкриват, че след консумация на диета от 300 mg/kg COS в продължение на 14 дни, микрофлората става по-разнообразна в резултат на добавката. Мишките, получаващи COS, показват увеличение на процента на Bacteroidetes тип и намаляване на процента на Firmicutes тип. След Citrobacter rodentium инфекция, хистопатологичните резултати показват, че COS храненето води до по-малко тежък колит. IL-6 и TNF-α са били значително по-ниски в дебелото черво от мишки, хранещи се с COS, отколкото тези в контролната група. Освен това беше установено, че мишките от групата на COS изпитват инхибирано активиране на ядрен фактор-капа B (NF-κБ) в дебелото черво тъкан. Като цяло констатациите разкриват, че добавянето на 300 mg/kg COS към диетата променя състава на чревната микрофлора на мишки, което води до потискане на NF-κБ активиране и по-малко производство на TNF-α и IL-6; и тези промени доведоха до по-добър контрол на възпалението и разрешаване на инфекцията с C. rodentium.

1. Въведение

Citrobacter rodentium, лигавичен патоген, открит при мишки, и ентеропатогенен Ешерихия коли (EPEC) и ентерохеморагичен Е. coli (EHEC), ентерогенни патогени, открити при хората, създават прикрепящи и заличаващи (A/E) лезии, които водят до колонизиране на лигавицата в чревния тракт [1, 2]. Чревният епител се инфилтрира от бактериални прикрепвания, микровилите на четката се изчерпват и структури под формата на пиедестал започват да се образуват под прилепващата бактерия [3]. Промените в тъканите на дебелото черво, сравними с EHEC и EPEC инфекцията, заедно с увеличаване на производството на възпалителни цитокини и инфилтрация на левкоцити, се предизвикват от A/E патогени след колонизацията на епител на дебелото черво [4]. C. rodentium сред популациите на мишки се използва от много изследователи за представяне на чревни Е. coli тъй като чревният EPEC или EHEC не заразява мишки.

Редица значителни чревни разстройства, открити при хората, също често се моделират от C. rodentium при мишки като туморогенеза на дебелото черво, улцерозен колит и болест на Crohn [5]. Колитът се развива при заразени мишки C. rodentium, в резултат на което бактериите стават прекомерни и естествената микробиота на мишките намалява в разнообразие и количество [6]. Когато се заразят, стават 1–3% от чревната микробиота на мишките C. rodentium [7], докато дебелото черво е атакувано от 10 9 единици, образуващи колонии (CFU) на g [8]. Генетичният състав на мишката влияе върху образуването на C. rodentium-индуциран колит, като мишки като C3H/HeJ и FVB/N са склонни да развият колит в резултат на инфекцията, а мишки като CD-1 и C57BL/6 се считат за тези, които не са склонни да развият колит и са само склонен към субклинични симптоми [9]. Уязвимост при договаряне C. rodentium, както и тенденцията да се покаже определен имунен отговор, е установено, че са силно свързани със състава на чревната микробиота [10].

В чревния тракт на човека се намират 500–1 000 вида микробиота в общо количество почти 100 трилиона [11]. Различни фактори, включително местоположението и диетата, оказват значително влияние върху метагенома, въпреки че тези фактори нямат същия ефект върху генома на един организъм. Изместването на патогена, извличането на енергия като SCFA от несмилаеми хранителни субстрати и развитието на имунната система зависят от чревната микробиота. Значителни промени в естествената хомеостаза на микробиотата са свързани с различни заболявания при хората [12].

COS е сред най-изобилните полизахариди, открити в насекоми, гъби, калмари, стриди, крил, миди и миди. Това е естествено N-деацетилирано производно на хитина [13]. Много изследователи са изследвали начините, по които експресията на Th1 и Th2 цитокините се влияе от COS [14]. При прасета [14], мишки [15], плъхове [16] и риби [17] COS служи като регулатор на имунния отговор. Въпреки това, малко се знае за това как чревната микробиота се повлиява от диетичните COS, въпреки малък брой проучвания, опитващи се да изследват това при прасета и пилета [18]. Би било полезно да се разбере дали чрез чревната микробиота COS може да изпълнява своите изгодни биологични функции, тъй като вече е известно, че редица биологични функции се влияят от чревната микробиота [19, 20]. Въпреки това, понастоящем съществуват малко констатации по темата C. rodentium, чревна микробиота и ефектите на COS добавките върху тях. По този начин, целта на това проучване е да се оценят ефектите от добавката на COS върху промените в състава на микробната флора, намаляването на възпалителната молекула (и/или увеличаването на противовъзпалителната молекула) и C. rodentium инфекция.

2. Материали и методи

2.1. Мишки и диета
2.2. C. rodentium Инфекция и мониторинг
2.3. Тъкани на дебелото черво: Хистологичен анализ

Дебелото черво на всяка мишка беше отстранено и фиксирано в 10% формалин. Хематоксилинът и еозинът са използвани за оцветяване и приготвяне на парафинови секции. Шест критерия (оток, язви, ерозия, възпаление, бокалена клетъчна хиперплазия и криптит) бяха очертани, за да се хистологично оцени колитът. Използвана е скала от 0–4 за оценка на лезиите, както следва: няма удебеляване на епитела/колит (0); незначителна епителна клетъчна хиперплазия/по-голямо количество мукозни левкоцити (1); възпаление в многобройни локуси, субмукоза и лигавица, инфилтрирани от левкоцити и/или значителна хиперплазия на епителни клетки (с 2-3-кратно нарастване на криптите) (2); по-голяма епителна клетъчна хиперплазия (3–10 пъти по-висок брой на криптите), намаляване на бокаловите клетки, секретиращи муцин, язва и/или значителна левкоцитна инфилтрация на субмукозата и лигавицата (3); изключително висока епителна клетъчна хиперплазия (10 или повече пъти по-висок брой на криптите), абсцеси на криптите и/или сериозна инфилтрация на трансмурални левкоцити (4).

2.4. 16S rDNA и Illumina MiSeq секвениране

След като се дава или базална, или COS диета за период от 14 дни, се събират изпражнения и се убиват 10 мишки от всяка група, за да се събере съдържанието на дебелото черво. След това фекалиите и съдържанието на дебелото черво бяха използвани за секвениране на 16S рДНК. Съгласно насоките за изолиране на ДНК, миниатюрен комплект за стол за стол на QiagenQIAamp е използван за извличане на ДНК от луминалното дебело черво и съдържанието на изпражненията. За да се създаде базова проба за всеки тип проба, бяха събрани равни количества ДНК от шест отделни мишки. Праймери 515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 ′ и 907R 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3 ′ (баркодът е осембазова последователност, индивидуална за всяка конкретна проба) бяха използвани за усилване на V4-V5 региона на бактерията 16S рибозомна РНК гена от PCR. Biotree, търговска фирма със седалище в Шанхай, извърши общия анализ на данните и последователността на Illumina MiSeq. Предишни констатации бяха използвани за насочване на библиотеките на MiSeq PE, последователността на MiSeq и допълнителен анализ [22]. Със съответните автори може да се свържете, за да поискате допълнителна информация относно референциите, необработените данни и последователността.

2.5. Анализ на иРНК на дебелото черво

IL-6 и TNF-α експресията са включени в анализите, които са настъпили след събирането и претеглянето на проксималното дебело черво. TRIZOL регент (Invitrogen, САЩ) се използва за екстракция на иРНК. Проведена е обратна транскрипция на cDNA и е използвана ABI 7500 Fast RT-PCR машина (Applied Biosystems), Superscript II обратна транскриптаза (Invitrogen) и oligo (dT) 20 за извършване на PCR в реално време.

2.6. Измерване на цитокини

50 mM Tris-HCl с 10

g/ml разтвор на инхибитор на протеаза (Sigma-Aldrich Co., USA) се използва за хомогенизиране на пробите от дебелото черво върху лед. Използва се центрофугиране от 20 минути върху хомогенатите при 30 000

g (4 ° C). След центрофугиране е използван сандвич ELISA Kit (ELISA Ready-SET-GO, eBioscience, CA, USA) за тестване на супернатантите за TNF-α и IL-6. Нормализирането на цитокина се извършва, за да съответства на нивата на протеин в дебелото черво.

2.7. NF-κB (p65) Имуноблотинг

NF-κЗа измерване на NF се използва комплект за анализ на транскрипционен фактор B (p65) (Cayman Chemical Company, MI, USA)-κB (p65) свързваща активност в ядрените екстракти. Протеините, извлечени от ядрени или цитоплазмени фракции, бяха взети в равни количества и след това (1) разделени с помощта на SDS-PAGE, (2) преместени в PVDF мембрани (Millipore, МА, САЩ) и запушени с използване на 5% обезмаслено мляко в Tris- Буфериран със солев буфер (20 mM Tris, рН 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) за период от 3 часа. Преди провеждането на анализа с Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech Corporation, CA, USA), инкубация през нощта при 4 ° C беше проведена с първичните антитела, докато 60-минутна инкубация при стайна температура беше проведена с конюгиран HRP вторичен антитела. Накрая се извърши електронно количествено определяне и нормализиране на интензитета на сигнала към изобилието на протеин Ламин В.

2.8. Статистически анализ на данните

SPSS 22.0 (Чикаго, IL, САЩ) беше използван за извършване на целия статистически анализ. Данните, илюстрирани в този раздел, са средните стойности ± стандартната грешка на средната стойност (SEM). Студентски

-тестът е използван за анализ на данните между две групи. В това проучване статистическата значимост е показана в стойности на

3. Резултати

Според измерванията на теглото, няма промяна в теглото на всяка мишка в нито една от двете групи. Освен това, както е показано на Фигура 1, при D7 след инфекция не се забелязва промяна в количеството C. rodentium във фекалиите или съдържанието на дебелото черво на всяка група. Въпреки това, както е показано на Фигура 2, значително увеличение на тежестта на колит се наблюдава при D7 след инфекция сред контролната група мишки в сравнение с мишките, снабдени с COS.