Афилиации Медицински факултет, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания, Център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

отговори

Партньорски център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

Партньорски център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

Партньорски център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

Партньорски център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

Партньорски център за сърдечно-съдови и метаболитни изследвания, Медицинското училище в Хъл Йорк, Университет в Хъл, Хъл, Великобритания

Отделение по биология на Университета в Йорк, Йорк, Великобритания

Присъединителен медицински факултет, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

Партньорски център за биологични науки, Университет в Саутхемптън, Обща болница в Саутхемптън, Саутхемптън, Великобритания

  • Judith J. Eckert,
  • Ричард Портър,
  • Адам Дж. Уоткинс,
  • Елизабет Бърт,
  • Сузани Брукс,
  • Хенри Дж. Лийз,
  • Питър Г. Хъмърсън,
  • Иен Т. Камерън,
  • Том П. Флеминг

Фигури

Резюме

Цитат: Eckert JJ, Porter R, Watkins AJ, Burt E, Brooks S, Leese HJ, et al. (2012) Индукция на метаболизма и ранни отговори на програмирането за развитие на миши бластоцисти след диета с ниско съдържание на протеин при майката, засягаща здравето през целия живот. PLoS ONE 7 (12): e52791. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052791

Редактор: Джейсън Глен Нот, Мичигански държавен университет, Съединени американски щати

Получено: 4 септември 2012 г .; Прието: 21 ноември 2012 г .; Публикувано: 27 декември 2012 г.

Финансиране: Авторите са благодарни за финансирането от BBSRC (BB/F007450/1, BB/I001840/1) на TPF и JJE в подкрепа на този изследователски проект. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Доказано е, че околната среда въздейства върху последващата програма за развитие при животински модели с дълготрайни последици, засягащи физиологията и здравословния статус на потомството [1] - [5]. По този начин при гризачите условията на култивиране in vitro [6] - [13] и ограничаването на протеините в майката in vivo [14] - [17] по време на предимплантационното развитие са свързани с необичаен постнатален растеж и повишен риск от заболяване при възрастни, характеризиращи се по-специално в сърдечно-съдова, метаболитна и поведенческа дисфункция. Подобни явления са наблюдавани и при сродни модели на ембриони на преживни животни [18] - [21]. Колективно тези чувствителности към околната среда на ранните етапи на развитие осигуряват подкрепа за важен компонент на хипотезата „Развитие на произхода на здравето и заболяванията“ (DOHaD), извлечена от епидемиологични и експериментални масиви от данни, предлагаща повишена чувствителност към хронични заболявания в по-късен живот от лишен от вътреутробно преживяване [22] - [25]. Ембрионалните ефекти върху околната среда също оказват влияние върху безопасността на практиките на асистирано зачеване [26] - [29].

Нашата скорошна работа, използваща модела за ограничаване на протеини на мишки, демонстрира, че майките, хранени с диета с ниско съдържание на протеини (9% казеин) изключително по време на периода преди имплантацията (E0-3.5; Emb-LPD) са генерирали потомство, показващо доживотна хипертония в сравнение с контролите и свързано с тях с отслабена артериална вазодилатация, повишена активност на белодробния ангиотензин-конвертиращ ензим, хиперактивно поведение и повишено затлъстяване [15] - [17]. Нашите данни също така показват, че ранният отговор на това преходно диетично предизвикателство (или след LPD, поддържан през цялата бременност) се отнася до активиране на компенсаторни механизми за стабилизиране на по-късния растеж на концептуса. Това включва доказателства за повишен капацитет за транспортиране на хранителни вещества между майката и плода през висцералната жълтъчна торбичка в края на бременността и съответно увеличение както на концептуса, така и на теглото при раждане след Emb-LPD на майката [15]. Освен това ранното индуциране на компенсация на растежа изглежда критично при по-късното начало на заболяването, тъй като перинаталното тегло на поколението Emb-LPD корелира положително с теглото на възрастните и податливостта към сърдечно-съдови и поведенчески заболявания [15].

Ние оценихме ефекта от лечението с Emb-LPD върху системната и репродуктивната система на майката върху мишката и развитието на ембрионите и фенотипа до момента на имплантацията. По-специално, ние се фокусираме върху диетичните ефекти върху наличността на АА в майчината циркулация и маточната течност и в рамките на бластоцисти. Ние също така оценяваме ефекта от диетата върху mTORC1 сигнализирането в рамките на бластоцисти и изследваме потенциалните компенсаторни механизми в рода на бластоцистната трофектодерма (TE). Колективно, нашите изследвания показват потенциална роля за АА и инсулиновия метаболитен сигнал чрез mTORC1 в индуцирането на програмиране на бластоцисти с доказателства за повишена пролиферация на ТЕ и инвазивно поведение в компенсаторен отговор по време на имплантацията.

Резултати

Emb-LPD променя състава на метаболитите в майчиния серум

Серумните метаболити от майки Emb-LPD и NPD са анализирани при Е3.5 и 4.5. Emb-LPD серумът при E3.5 е изчерпан в инсулин и повишен в глюкоза (P Фигура 1. Концентрация на майчините серумни метаболити при E3.5 и 4.5 след третиране с Emb-LPD и NPD.

(А) инсулин, п = 11-16 за лечение; (В) глюкоза, п = 13–20 на лечение; (C) кортикостерон, n = 11-16 на лечение; (D) естроген, n = 6-11 на лечение; (E) прогестерон, n = 6-11 на лечение. * P Фигура 2. Аминограми в отделения в различни часови точки след третиране с Emb-LPD и NPD.

(A) Майчин серум, (B) маточна течност в дни 2,5, 3,5 или 4,5 и (C) бластоцисти в ден 3,5, взети от таблици 1, 2, 3.

Концентрацията на АА в маточната течност (UF) се анализира по отношение на майчината диета при Е2.5, 3.5 и 4.5 (Таблица 2, Фигура 2В). Не бяха открити разлики между диетичните лечения за индивидуални концентрации на АА при Е2.5. При Е3.5 трите разклонени вериги АА, изолевцин, левцин и валин, както индивидуално, така и колективно, бяха изчерпани (P Таблица 2. Концентрации на свободни аминокиселини в маточната течност от мишки, хранени с NPD или Emb-LPD при 2.5, 3.5 или 4,5 дни бременност.

Събраните бластоцисти при Е3.5 бяха бързо измити и незабавно обработени за АА състав (Таблица 3, Фигура 2С). Този анализ разкрива, че индивидуалният АА аспарагин е изчерпан (P Таблица 3. Концентрация на свободна аминокиселина в бластоциста и относителен% на ден 3.5 от бременността от мишки, хранени с NPD или Emb-LPD от сутринта след чифтосването.

Различните майчини (серумни, UF) и бластоцистни басейни на АА показват забележими промени в концентрацията с бластоцисти, показващи най-високите нива на концентрация за повечето АА. В таблица 4 и фигура 3 промяната в концентрацията на отделни и групирани АА между тези пулове се отчита както за лечение с NPD, така и за Emb-LPD. АА съставът на бластоцистите и UF е по-сходен в сравнение със серума.

(A) Лечение на Emb-LPD и (B) NPD на ден d3.5, както е взето от таблица 4.

Emb-LPD предизвиква промяна в mTORC1 сигнализирането в бластоцисти

Количествено имуноблотинг на mTORC1 мишени надолу по веригата (A – C) S6 протеин, (D – F) 4E-BP1 протеин, нормализиран към α-тубулин. Представителни петна за (A) общо S6; (В) фосфорилиран S6; (C) относителна интензивност на общия, фосфорилиран и съотношението на S6 в Emb-LPD и NPD бластоцисти; (D) общо 4E-BP1; (Е) фосфорилиран 4E-BP1; (C) относителна интензивност на общия, фосфорилиран и съотношението на 4E-BP1 в Emb-LPD и NPD бластоцисти. Индивидуалните блотирани ленти включват MW маркери (вляво) и проби от бластоцисти Emb-LPD (L) и NPD (N) (25 бластоцисти на лента) и контрол на натоварването (LC, обединени бластоцисти при 25 на лента). * P Фигура 5. Ефекти на майчината диета върху бластоцисти и израстъци.

(A) Emb-LPD и NPD зрялост на бластоциста при E3.5. n = 13–15 майки на лечение. (B) Emb-LPD и NPD брой на бластоцистните клетки при E3.5 и E3.75 в рамките на трофектодерма (TE) и ICM и общи пулове, * P 125 I RIA комплект (ICN Biomedicals, UK) и 1274 RiaGamma брояч (LKB- Wallac, Финландия). Естрогенът се определя с помощта на третия генерален естрадиолов RIA комплект (DSL, Великобритания) и прогестерон, използвайки 17α-OH прогестеронов 125 I RIA комплект (DSL, Великобритания), и двата отчетени с помощта на 1274 брояч RiaGamma.

Колекция от маточна луминална течност

Събиране и лечение на ембриони

Ембрионите се събират по различно време по време на диетично лечение от майки чрез дислокация на шийката на матката, дисекция на репродуктивния тракт и промиване на ембриони, като се използва среда H6, допълнена с 4 mg/ml BSA (H6-BSA) [9]. За анализ на състава на свободните аминокиселини се оценяват стадийът и диаметърът на бластоциста (ранен, среден, разширен), последван от три задълбочени измивания в PBS, допълнени с 0,1% PVA, преди замразяване с флаш в групи от 8–10 (разделени от на майка) в 10 µl вода с HPLC-клас във флакони с HPLC върху сух лед възможно най-бързо. Тази процедура отнема по-малко от 10 минути на майка и анализът на измиване не показва никакви или фонови следи от АА, дори ако ембрионите са оставени до 30 минути, което предполага липса или незначително изтичане по време на процеса на събиране.

За оценка на броя на клетките, ембрионите са били подложени на диференциално ядрено маркиране след лизис на трофектодерма, медииран от комплемента [78] с модификации. Накратко, ембрионите бяха поставени в 10% тетранитробензен сулфонова киселина (TNBS; Sigma, UK) в H6 + 0,1% PVA за 10 минути, измити 3 пъти в H6-BSA, инкубирани в 0,4 mg/ml заешки анти-динитрофенил (анти-DNP ) антитяло (Sigma, UK) в H6-BSA в продължение на 10 минути, измито в H6-BSA и инкубирано в 25 µl капка от разтворения комплемент на морски свинчета с ниско съдържание на токси (разреждане 1-10, Cedarlane, Канада) с 2 µl пропидиев йодид (PI; Sigma, 1 mg/ml) в продължение на 10 минути при 37 ° С. Ембрионите се измиват в H6-BSA, фиксират се в етанол плюс 1% бисбензимид (Sigma) при 4 ° C, измиват се в пресен етанол, монтират се в глицерол върху стъклено стъкло, преглеждат се в изправен епифлуоресцентен микроскоп Zeiss Axiophot и ядра, преброени с помощта на софтуера Metamoph (Версия 6.2r6).

За да се оцени по-нататъшното развитие и потенциал за израстване, бластоцистите се поставят индивидуално в 20 µl капки KSOMufaa, допълнени с 10% FCS (KSOMufaa + FCS) под масло и се оставят да се прикрепят и разпространяват до 120 часа. KSOMufaa включва KSOM среда (Sigma), допълнена със средния състав на AA, идентифицирани в UF на майките с NPD при E3.5 (Таблица 2). Морфологията и свързването на бластоцисти се оценяват на всекидневни интервали, като се използва инвертиран микроскоп Zeiss Axiovert, снабден с камера на околната среда при 37 ° C, и светли полеви изображения, направени на всеки 24 часа за измерване на площ с помощта на софтуера Metamorph. Израстъкът на бластоциста също се провежда за специфични периоди със среда, съдържаща рапамицин (2 или 20 µM; LC лаборатории, Woburn, САЩ) или носител (0,05% DMSO), за да инхибира mTORC1 активността.

Анализ на аминокиселини

Концентрациите в серума и UF от 19 AA са определени с помощта на автоматизирана система за течна хроматография с обратна фаза от серия Kontron 500, оборудвана с флуоресцентен детектор Jasco F920 и 4,5 mm × 250 mm Hypersil ODS-16 колона (Jones Chromatography, Glamorgan, UK). Пробите от серум и UF се разреждат от 1/12,5 до 1/112,5 с PBS или HPLC вода (Fisher Scientific, UK) в зависимост от типа на пробата и AA, които трябва да бъдат открити; дериватизиран (предколона) с о-фталдиалдехид [51], D-хомосерин и α-амино маслена киселина; се изпълняват в два екземпляра и се сравняват с 10 µmol l-1 AA стандарти. За анализ на бластоциста АА се използва колона 4,6 mm × 250 mm Hyperclone 5u ODS (C18) 120A (Phenomenex, Macclesfield, UK). Пробите се разреждат 1 1 с HPLC вода и се сравняват с 10 цМ стандарти и отрицателни контроли (промивна среда и HPLC вода). За изчисляване на абсолютните концентрации се взема предвид обемът на бластоциста за всяка проба.

Blastocyst mTORC1 Активност

Статистика