Стефани Е. Волгемут

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

ефектите

Хейзъл А. Лийз

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Емануеле Марцети

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

2 Катедра по ортопедия и травматология, Католически университет на Свещеното сърце, Рим, Италия.

Тод М. Манини

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Хуан М. Аранда

3 Катедра по медицина, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Майкъл Дж. Даниелс

4 Департамент по статистика, Колеж за свободни изкуства и науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Марко Пахор

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Майкъл Г. Пери

5 Катедра по клинична и здравна психология, Колеж по обществено здраве и здравни професии, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Кристиан Лиуенбърг

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Стивън Д. Антон

1 Катедра по стареене и гериатрия, Институт за стареене, Медицински колеж, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

5 Катедра по клинична и здравна психология, Колеж по обществено здраве и здравни професии, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида.

Резюме

Въведение

Базираните на начина на живот интервенции могат да отслабят загубата на мускулна маса и да подобрят телесния състав при затлъстели възрастни хора, но все още не е установен оптимален метод. Калорично ограничение (т.е. калориен дефицит от 500–1000 kcal/ден под стабилно състояние) обикновено се изисква, за да се постигне значителна загуба на тегло. Индуцираната от диетата загуба на тегло обаче обикновено води до намаляване на масата без мазнини, което е сериозна грижа за възрастните възрастни. За разлика от това, интервенциите с упражнения могат да увеличат мускулната маса, да подобрят мускулното качество, 11,12 и да увеличат синтеза на мускулни протеини, 13 но рядко водят до значителна загуба на тегло, освен ако хората не участват в много големи количества умерена или енергична активност. 14 Следователно предизвикателството за клиницистите и изследователите, работещи с възрастни хора с наднормено тегло, е да разработят интервенции, основани на начина на живот, които могат да доведат до значителна загуба на тегло, като същевременно се избягва (или ограничава) загубата на маса без мазнини. 15

Производството на енергия от здрави митохондрии е също толкова важно, колкото и клетъчните процеси за контрол на качеството за поддържане на клетъчната функция. Въпреки това, митохондриалната функция намалява с възрастта и дисфункционалните митохондрии се натрупват, причинявайки допълнителни клетъчни увреждания (за преглед вж. Справки 26 и 27). Следователно, автофагичното отстраняване и разграждане на увредените митохондрии, балансирани с митохондриална биогенеза, са от съществено значение за предотвратяване или смекчаване на свързания с възрастта спад на клетъчната функция. При по-млади хора упражненията и ограничаването на калориите стимулират митохондриалната биогенеза в скелетните мускули. 11,12 В допълнение се увеличава броят на кристите на митохондрия, както и компонентите на митохондриалната електронна транспортна верига. 14 Все пак дали същите ефекти се наблюдават при възрастни възрастни след упражнение и диета, все още не е установено. Ако се наблюдават подобни биологични промени при възрастни възрастни, тогава подобренията в митохондриалната функция могат да бъдат друг механизъм, чрез който загубата на тегло плюс упражненията могат да подобрят физическата функция и да намалят функционалния спад при възрастните с наднормено тегло.

Следователно целта на настоящото проучване беше да се оцени в скелетните мускули на възрастни жени с наднормено тегло въздействието на загуба на тегло плюс интервенция при упражнения върху маркери на автофагия, компоненти на UPS, както и маркери на възпаление, апоптоза и митохондриални биогенеза и функция. Ние предположихме, че комбинацията от диетични ограничения и упражнения ще стимулира клетъчните процеси за контрол на качеството (по-специално автофагията и компонентите на протеизомния път на убиквитин), ще отслаби възпалението и апоптозата и ще подобри митохондриалната функция. Също така предположихме, че физическото представяне на лица, участващи в загуба на тегло плюс упражнения, ще бъде подобрено.

Материали и методи

Участници

За настоящото изследователско проучване бяха включени общо 13 участници, които се съгласиха да се подложат на кожна биопсия на мускулите преди (преди) и след (след) намеса. От тези участници 7 са били рандомизирани в образователната контролна група и 6 в групата за отслабване плюс упражнения (WL + E). Имайте предвид, че мускулните биопсии не дават достатъчно количество тъкан за извършване на всички анализи на всички участници. Броят на участниците, включени във всеки от проведените анализи, е посочен в съответните графики или таблици.

Проучване дизайн и интервенции

По-голямото рандомизирано контролирано проучване, от което е извлечена подгрупата на това изследователско проучване, включва еднослепо проучване, при което персоналът, отговорен за тестването, е ослепен за назначената от участника интервенционна група. Допустимите участници бяха рандомизирани или за WL + E интервенция, или за образователна контролна група. PROC PLAN на SAS е използван за компютърна рандомизация. 29

Интервенцията WL + E е насочена към 6% или повече загуба на тегло чрез умерено намаляване на енергийния прием (т.е. намаление от 500–1000 kcal/ден), съчетано с упражнения, по време на които участниците са участвали както в аеробни дейности (т.е. ходене), така и тренировка за съпротива с умерена интензивност на ниско тяло. Участниците присъстваха на седмична групова сесия за управление на теглото, водена от регистриран диетолог и докторант с обучение по наука за поведението. Калоричното разпределение на всеки участник представлява дефицит от 50750 kcal/ден от нейния прогнозен енергиен прием на изходно ниво, определен чрез анализ на хранителните записи. Такова ограничаване на калориите има за цел да насърчи загуба на тегло със скорост от 1,5 паунда (0,7 кг)/седмица. В съответствие с диетичните препоръки на Американската сърдечна асоциация, 30 диетата съдържа съответно 55%, 30% и 15% от енергийния прием от въглехидрати, мазнини и протеини. Храната се избира самостоятелно под наблюдението на регистриран диетолог. Участниците бяха инструктирани да попълват дневни записи за храна, които те носеха на всяка групова сесия. По време на тези групови сесии, записите за храна на всеки участник бяха прегледани от регистрирания диетолог, който предостави конкретни предложения относно диетичните промени, за да помогне на участниците да постигнат своята калорична цел.

Интервенцията с упражненията се състоеше от аеробни, силови тренировки и упражнения за гъвкавост. Разходката беше основната аеробна активност, но други форми на дейност (например стационарно колоездене) също бяха използвани, ако участниците не можеха да ходят поради нараняване. След третата седмица участниците бяха насърчавани да постигнат седмична цел за ходене от 150 минути. По време на интервенцията се провеждаха три упражнения с наблюдение всяка седмица. Кръвното налягане и сърдечната честота се наблюдават преди и след всяка тренировъчна сесия, която е предшествана от кратко загряване и последвано от период на разхлаждане. По време на всяка сесия участниците изпълниха два 15-минутни пристъпа на ходене. След първия пешеходен двубой, участниците бяха напътствани да изпълнят набор от пет упражнения за долната част на тялото (т.е. широк клек, извиване на крака, удължаване на коляното, странично повдигане на бедрата и стойка на пръстите) по време на 15-минутна тренировка за силова тренировка. За всяко упражнение участниците бяха насърчавани да изпълнят един набор от 10 повторения, да си починат 1 минута и след това да изпълнят втори набор. Тежестите на глезените са използвани за осигуряване на нарастващи нива на съпротивление. След втория си пешеходен двубой участниците се включиха в 5-минутен период на охлаждане, през който изпълниха поредица от упражнения за гъвкавост.

Участниците бяха въведени постепенно в упражненията за интервенция, започвайки с упражнения с по-лек интензитет и постепенно увеличавайки нивото на интензивност през първите 2-3 седмици от интервенцията. След първоначалната фаза на адаптация, участниците бяха инструктирани да започнат да ходят с умерено ниво на интензивност, определено от скалата за възприемане на Борг. 31 Участниците бяха помолени да ходят с ниво на интензивност 13 (възприемането на дейността „донякъде трудно“) и те бяха обезкуражени да упражняват на нива над 15 („трудно“) или на ниво 11 („доста трудно“) и по-долу. Що се отнася до компонента за силова тренировка, участниците бяха насърчавани да изпълняват всяко упражнение с ниво на интензивност 15–16 („твърдо“).

Участниците в образователната контролна група бяха помолени да поддържат обичайните си режими на хранене и физическа активност и да не се ангажират с никакви умишлени усилия, насочени към отслабване в продължение на 6 месеца. По време на интервенцията участниците в тази група посещаваха месечни лекции за здравно образование по теми, свързани с възрастни възрастни, които не бяха свързани със загуба на тегло, диета или физическа активност (например защита на кожата, хигиена на съня). След техните 6-месечни оценки участниците в тази група получиха възможността да получат пълната 24-седмична WL + E интервенция.

Измервания за антропометрични и физически функции

Теглото на тялото се измерва на гладно и след изпразване на сутринта преди началото на интервенцията и отново след нейното приключване. Физическата функция се оценява чрез определяне на скоростта на ходене над 400 метра. Участниците бяха помолени да преминат стандартен курс по ходене с обичайното си темпо. По време на разходката на участниците беше позволено да спрат, но не им беше позволено да седят или да получават помощ от други и се изискваше да завършат курса в рамките на 15 минути.

Мускулна биопсия

Биопсии бяха получени от мускула на ogromus lateralis подкожно, преди (преди) и след 6 месеца (след) интервенция. Мускулните проби се почистват от кръв и мазнини и незабавно се замразяват в течен азот за биохимични анализи. Отделно парче тъкан беше потопено в RNAlater (Ambion, Austin, TX) и замразено в течен азот за изследвания на генната експресия. Броят на участниците в група в съответния анализ се отбелязва в графики или таблици. Имайте предвид, че не можахме да извършим всички анализи на всички проби поради тъканни ограничения от някои участници.

Експресия на протеин: субклетъчно фракциониране и имуноблотинг

Извършва се субклетъчно фракциониране на мускулни проби, както е описано по-горе. 32 цитозолни фракции бяха използвани за откриване на разцепена каспаза 3 (Millipore, Temecula, CA) и активна каспаза 8 (Abcam, Cambridge, MA). Измервани са субединица 4 на цитохром c оксидаза (Cox4; Cell Signaling, Danvers, MA), субединица 1 на цитохром c оксидаза (Cox1; Mitosciences, Eugene, OR) и фактор на транскрипция на митохондриите A (TFAm; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) в митохондриалната фракция, докато ендонуклеаза G (EndoG; Abcam, Cambridge, МА) и фактор, индуциращ апоптоза (AIF; BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) са изследвани както в митохондриалната, така и в ядрената фракция. Електрофореза и имуноблотинг бяха извършени както е описано другаде. 32 цифрови изображения бяха заснети с изображение на Alpha Innotech Fluorchem SP (Alpha Innotech, San Leandro, CA) и анализирани с помощта на софтуера AlphaEase FC (Alpha Innotech). Точковата плътност на целевите ленти (единици с произволна оптична плътност [OD]) се нормализира до общото количество протеин, зареден във всяка лента, както се определя чрез денситометричен анализ на съответните S-оцветени мембрани на Ponceau. 33

Експресия на гена: Количествена PCR в реално време

Активност и съдържание на митохондриални дихателни комплекси: Електрофореза в синия естествен полиакриламиден гел

Митохондриална екстракция

Приблизително 40 mg мускули се хомогенизират в 1 ml екстракционен буфер (20 тМ 3- (N-морфолино) пропансулфонова киселина [MOPS], 440 тМ захароза, 1 тМ EDTA и 0,5 тМ фенилметилсулфонил флуорид [PMSF], рН 7,2 при 4 ° C) и се центрофугира при 500 × g за 10 минути. Супернатантата се събира и центрофугира при 20 000 х g за 20 минути. Получената пелета се ресуспендира в 30 μL буфер (1 М аминокапронова киселина, 50 тМ Bis-Tris и 0,2 тМ PMSF, рН 7,0 при 4 ° С) и се постига разтваряне на мембраните с 30% n-додецилмалтозид. Суспензията се инкубира върху лед в продължение на 30 минути с завихряне на всеки 5 минути и след това се центрофугира при 100 000 × g в продължение на 30 минути (ултрацентрифуга Beckmann Optima LE-80K, ротор 50.2 Ti, 28 300 об/мин). Получената супернатанта се събира и съхранява при -80 ° С.

Нативна електрофореза

Пробите се приготвят с 10% тегл./Об. Coomassie Brilliant Blue G-250 в аминокапронова киселина (1 М) и глицерол. Приблизително 40 μg пробен протеин и 15 μg контролен протеин (говежди сърдечни митохондрии, Mitosciences) се зареждат в 3-12% градиентни сглобяеми гелове (Invitrogen, Carlsbad, CA). Текущите буфери включват ледено студен катоден буфер (50 mM трицин, 15 mM Bis-Tris, рН 7,0 при 4 ° C) и аноден буфер (50 mM Bis-Tris, рН 7,0 при 4 ° C). Накрая се добавят 10 ml катоден буфер, съдържащ 0,5% Coomassie Brilliant Blue G-250 и се смесва с катодния буфер в гел апарата. Електрофорезата се извършва при 4 ° С, както следва: 70 V за 30 минути, след това 170 V за приблизително 1 час. Катодният буфер беше премахнат и заменен с катоден буфер без петно ​​Coomassie. След това гелът се пуска при 170 V за около 2 часа.

Анализ на активността в гела

Веднага след електрофорезата са проведени ензимни колориметрични реакции в гел за комплекси I, II, IV и V, според Zerbetto et al. 35 Буфери за активност бяха, както следва: комплекс I (никотинамид аденин динуклеотид [NADH] дехидрогеназа), 2 mM Tris · HCl, 0,1 mg/ml NADH и 2,5 mg/ml NBT (нитро син тетразолий), разреден 1:10 (тегл./Об.) ); комплекс II (сукцинат дехидрогеназа), 1,5 mM фосфатен буфер, съдържащ 4,5 mM EDTA, 10 mM калиев цианид, 0,2 mM феназин метосулфат, 84 mM натриев сукцинат, 10 mM нитроблуев тетразолиев хлорид; комплекс IV (цитохром с оксидаза, COX), 5 mg 3,3 диаминобензидин, разтворени в 9 ml 50 mM фосфатен буфер, 10 mg цитохром c, 0,05 ml каталаза (20 μg/ml) и 0,75 mg захароза; комплекс V (аденозин трифосфат [ATP] синтаза), 35 mM Tris, 270 mM глицин, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb (NO3) 2 и 8 mM ATP. Всички буфери бяха с рН 7.4. Ензимните реакции се оставят да продължат, докато се наблюдава оптимален цвят. Изображенията са заснети с изображение на Alpha Innotech Fluorchem SP (Alpha Innotech) и количествено определяне с помощта на софтуера AlphaEase FC (Alpha Innotech). Точковата плътност на целевите ленти (произволни OD единици) се нормализира до сложно съдържание.

Сложно съдържание

За определяне на сложното съдържание е извършен Western blot анализ. Митохондриалните екстракти се електрофорезират, както е описано по-горе. След това мембраните бяха инкубирани за една нощ с първични антитела срещу всеки от комплексите (1: 200) (Mitosciences). Вторичната инкубация на антитела, генерирането на хемолуминесцентния сигнал, цифровото улавяне и денситометрията на лентите се извършват, както е описано по-горе. Общото количество протеин, зареден във всяка лента, се определя чрез оцветяване на Ponceau S и се използва като контрола на натоварването.