Институт по здравни науки на Nestle, Когнитивно здраве и стареене, Иновационен парк EPFL, сграда H, 1015, Лозана, Швейцария

остарелите

Институт по здравни науки на Nestle, Когнитивно здраве и стареене, Иновационен парк EPFL, сграда H, 1015, Лозана, Швейцария

Фигури

Резюме

Цитат: Wang D, Mitchell ES (2016) Когнитивни и синаптично-пластични промени, свързани с остарелите плъхове, допълнени с 8- и 10-въглеродни средноверижни триглицериди. PLoS ONE 11 (8): e0160159. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0160159

Редактор: Yael Abreu-Villaça, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, БРАЗИЛИЯ

Получено: 7 януари 2016 г .; Прието: 14 юли 2016 г .; Публикувано: 12 август 2016 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: ESM и DW са служители на Nestle Institute of Health Sciences, институция с нестопанска цел, и са получили подкрепа под формата на заплати. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: ESM и DW са служители на Nestle Institute of Health Sciences, институция с нестопанска цел. Това не променя придържането на авторите към политиките PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Октановата киселина и декановата киселина, съответно 8-въглеродни и 10-въглеродни мастни киселини със средна верига (MCFA) се намират като средноверижни триглицериди (MCT) в храни като кокосово масло и козе мляко. За разлика от по-дълговерижните мастни киселини като палмитиновата киселина, MCFA могат бързо да проникнат в кръвта и да съществуват като свободни мастни киселини, които свободно преминават през клетъчните мембрани. При навлизане в порталната вена MCFA се превръщат в кетони (бета-хидроксибутират, ацетат и ацетоацетат), които могат да бъдат погълнати в мозъка чрез MCT1 транспортери [1]. Кетоните действат като субстрати за производството на ацетил-КоА, като по този начин те могат да служат като алтернативни източници на енергия, когато глюкозата е ниска [2]. Това свойство на байпас на гликолизата на кетоните е особено важно за невроните, които използват глюкоза или кетони като първични енергийни източници за производството на АТФ. Доказано е, че пациентите с болестта на Алцхаймер (AD) намаляват метаболизма на мозъчната глюкоза и гликолитичните ензими, поради което кетоните могат да бъдат полезни като помощно гориво [3]. Последните изследвания показват, че кетоните, получени от средноверижни мастни киселини, подобряват познанието при пациенти с диабет и АД и отслабват невродегенерацията в модел на мишка ALS [4].

Въпреки че по-голямата част от приетите MCFA се превръщат в кетони, проучванията на ADME показват, че MCFA самите те могат да навлязат в мозъка и да имат различни ефекти върху невронната функция [5,6]. Например, средноверижните мастни киселини активират свободни мастни киселини, чувствителни на G-протеинови рецептори, като GPR40 и GPR84, които са силно изразени в мозъка и имат роля в регулирането и възпалението на глюкозата [7]. Наскоро е показано, че средноверижните мастни киселини модулират митохондриалната ензимна функция в клетъчната линия на невробластом [8]. По-конкретно 6-дневното приложение на декановата киселина повишава цитрат синтазата, комплекс I и каталазната активност, докато октановата киселина няма ефект. Интересното е, че е доказано, че декановата киселина е лиганд за PPAR гама рецептори, докато октановата киселина няма активност [9]. Междувременно октановата киселина е използвана почти изключително в проучвания върху хора и животни, оценяващи когницията, поради нейния предполагаем превъзходен кетогенен потенциал.

Не е известно дали триглицеридът на декановата киселина (MCT10) също оказва влияние върху познанието, тъй като няма публикувани проучвания, които да оценяват MCT10 за ефекти върху свързания с възрастта когнитивен спад. Освен това понастоящем не е известно дали MCFA като октанова киселина или деканова киселина, които се освобождават след консумация на MCT, имат диференциално въздействие върху метаболитната функция на невронните клетки in vivo.

В настоящото проучване леченията с MCT10 и MCT8 са хранени на възрастни плъхове в продължение на 8 седмици и тяхното когнитивно представяне е сравнено с възрастни плъхове, получаващи хранителна добавка със слънчогледово масло.

Методи

Животни, лечение, измерване на кетони и MCFA

Тестване на поведението

Социално признание.

Плъховете бяха тествани за поведенчески ефекти на MCT чрез тест за социално взаимодействие 3 дни преди жертвата. Този тест включва въвеждането на непознат непълнолетен плъх в домашната клетка на тествания плъх за 4 минути. Записано е количеството докосване, подушване и общо изследване на непълнолетния плъх, а общият период на социално взаимодействие е използван като показатели за социалност и тревожност. След 1 час изследвания по-рано непълнолетен и нов непълнолетен бяха въведени в домашната клетка за 4 минути. Ако плъх не е успял да изследва непълнолетния за повече от 30 секунди по време на първата сесия, той не е включен в крайния анализ. Социалното признаване се изчислява от времето, прекарано в проучване на новия непълнолетен, спрямо общото време, прекарано в проучване на двамата непълнолетни (JNEW/(JNEW + JOLD)).

Разпознаване на открито поле и обект.

Екстракция на протеини

Проби от мозъчна тъкан на плъх се хомогенизират в буфер, съдържащ NaCl 1M, EDTA 0.5M, EGTA 0.5M, NaF 0.5M, Na4O7P4 0.2M, Na3VO4 0.5M, Triton-100, SDS 10%, деиксихолат 5%, PMSF 200mM и протеазен инхибитор коктейл (Roche). Протеинът се получава след центрофугиране на хомогената при 10000 g в продължение на 10 минути при 4 ° С. Концентрацията на протеин се определя по метода на Брадфорд.

IRS-1, IGF-1, GDNF и VEGF ELISA

Уестърн петна

NuPAGE Novex Midi гелове (4–12%) от Life Technologies бяха използвани за разделяне на протеини. Използвани са следните антитела: Anti-PSD95 антитяло (Abcam, Cat. # Ab18258), Synaptophysin (D35E4) XP ® Rabbit mAb (Cell Signaling, Cat. # 5461), Complex II Subunit Monoclonal Antibody (клон 21A11AE7, Life Technology, # 439454), Phospho-p70 S6 киназа (Thr421/Ser424) (клетъчна сигнализация, # 9204), S6K (p70) (клетъчна сигнализация, # 2217), Phospho-Akt (Ser473) антитяло (клетъчна сигнализация, кат. 9271s), Akt (тиган) (11E7) заешки mAb (клетъчна сигнализация, кат. # 4685s), Ube3a (абгент, # 346954), β-тубулиново антитяло (TUB 2.1, Санта Круз, кат. # Sc-58886) и β-актин антитяло (Sigma, Cat. # A1978). След инкубиране със съответните инфрачервени флуоресцентни вторични антитела от Li_COR Biosciences (# 926–32213 IRDye ® 800CW Donkey anti-Rabbit IgG и # 926–68072 IRDye ® 680RD Donkey anti-Mouse IgG), сигналът на специфичен протеин беше открит и количествено определен изображението на Odyssey CLx (LI-COR).

Детекция на генна експресия чрез PCR

Общата РНК беше извлечена и пречистена с тъканния комплект RNAdvance (Agencourt, Beverly, МА, САЩ). Качеството на пробите от РНК се проверява с помощта на анализатор на фрагменти (Advanced Analytical Technologies, Inc, Ames, IA, USA). Обратната транскрипция беше извършена с помощта на PrimeScript Reagent kit от Katara Clontech (Cat. # RR037A) следвайки инструкциите на производителя, използвайки 500 ng от всяка РНК проба. След добавяне на LightCycler ® 1536 DNA Green Master (Roche, Cat. # 5573092001), генната експресия беше количествено определена на Roche LightCycler 480. За PCR реакцията бяха използвани праймери за следните гени: Arc, Egr1, Egr2, Fosb, Srf, nr4a1, Plk3, Junb, Grin1, Gba2 и бета-тубулин е използван като ендогенен контрол.

Плъх-Egr1-F: aacaaccctacgagcacctg; Плъх-Egr1-R: aaaggggttcaggccacaaa;

Плъх-Fosb-F: gccttcaactagcacaagcac; Плъх-Fosb-R: ctgatccgtttccgcctgg;

Плъх-Srf-F: atgcagtgatgtatgccccc; Плъх-Srf-R: cagccatctggtgaagctga;

Плъх-Nr4a1-F: gcatggtgaaggaagttgtcc; Плъх-Nr4a1-R: aaaattgctgcacgtcaccg;

Плъх-Egr2-F: aaacggcttctctggcactc; Плъх-Egr2-R: ttgatcatgccatctccagcc;

Плъх-Junb-F: gtttacatggcccccttcca; Rat-Junb-R: agtatccccacaggctgagt;

Плъх-Arc-F: acagacacagcagatccagc; Плъх-Arc-R: tgagtcatggagccgaagtc;

Плъх-Gba2-F: ctaccctgcatgttgtccgt; Плъх-Gba2-R: tcagctgtccggaaaccttc;

Плъх-Grin1-F: cttcagtccctttggccgat; Плъх-Grin1-R: agttggcagtgtaggaagcc,

Плъх-актин-F: gtcgtaccactggcattgtg; Плъх-актин-R: ctctcagctgtggtggtgaa

Плъх-Plk3-F: gcaagcagtggagatggatt; Плъх-Plk3-R: ggacagctgatagccaaagc

Статистически анализ

Еднопосочните ANOVA са използвани за анализи на поведението, експресията на протеини и иРНК. Промяната в теглото се анализира чрез многократно измерена ANOVA. Ако са установени значителни разлики между групите, тогава използваните post-hoc тестове са Tukey, за сравнения с контролната група или Bonferroni сравнения между MCT групите. Всички данни са представени като средна стойност (± SEM).

Резултати

Тегло, плазмени кетони и средноверижни мастни киселини

Диетата изглежда се понася добре от всички групи, но поради екстремната възраст на животните 3 животни умряха през последната седмица на интервенцията: 1 смъртност в контролната група и 2 смъртност в групата MCT8. Тези животни не са били включени в поведението, следкланичните или кръвни анализи. Няма значим ефект от лечението с MCT върху приема на храна (среден прием на ден в грамове: CON, 23,3 ± 2,4; MCT8, 21,6 ± 1,4; MCT10 22,1 ± 1,8). Въпреки никаква разлика в приема на храна, и двете MCT лечения поддържат сходно телесно тегло по време на интервенцията, докато групата, добавена към слънчогледово масло, набира тегло (Фиг. 1А). Плазменият бета-хидроксибутират (BHB), измерен чрез колориметрични набори, се увеличава в групата, лекувана с MCT10 и MCT8, в сравнение с контролите (фиг. 1В), но BHB на мозъка, измерен чрез GC-MS, са сходни във всички групи (фиг. 1С). Измерването на плазмената октанова киселина в групи, третирани с MCT8, е средно 6,4 ± 1,4 μM (фиг. 1D), докато средните нива на плазмена деканова киселина за групата MCT10 са 18,2 ± 2,1 μM (фиг. 1Е).

(A) процентна промяна в теглото, * p Фиг. 2. Когнитивните показатели се повишават в MCT групите в сравнение с контролната диета чрез еднопосочен ANOVA анализ.

(А) социално признаване на изходно ниво и 8 седмици след хронично лечение с МСТ. ** p Фиг. 3. Инсулин, сигнализиращ протеин фосфорилиране и растежни фактори.

(A) IRS-1 фосфорилиране ser (307) *, p Фигура 4. свързани с синапса протеини и пътища, свързани с растежа.

(A) S6K (p70) фосфорилиране (pS 240/244) F (2,8) = 10,8 *, p Фигура 5. Относителна експресия на иРНК в префронтална кора на плъхове, третирани с MCT: транскрипционни фактори, свързани с пластичността.