1 Екип от натурални продукти, Naturech Co, Ltd., Chungcheongnam-do 31257, Република Корея

детелина

Резюме

1. Въведение

Менопаузата е естествен процес, който се развива при жените обикновено в края на 40-те години и включва намаляване на нивата на естроген, особено поради спада на яйчниците [1, 2]. Това намаляване на нивата на естроген е придружено от различни симптоми, като горещи вълни, нощно изпотяване и депресия [3]. Недостигът на естроген може да доведе до повишен риск от метаболитни заболявания, като затлъстяване, сърдечни заболявания, диабет и хипертония [4–6]. Освен това влияе върху атерогенния липиден профил, като нивата на липопротеини с висока плътност (HDL) и липопротеини с ниска плътност (LDL) холестерол [7].

Хормоналната терапия е основната възможност за лечение на симптомите на менопаузата; обаче дългосрочното лечение чрез този подход може да причини сърдечно-съдови събития и рак на гърдата [8]. Притесненията относно безопасността на хормоналните продукти увеличиха популярността на много допълнителни терапии като екстракт от червена детелина. Различните симптоми на менопаузата намаляват качеството на живот на жените в менопауза, затова е важно тези симптоми да се управляват здравословно и правилно чрез хранителни добавки, при които липсват странични ефекти.

Червена детелина (Trifolium pratense L.) има естрогенни ефекти поради наличието на изофлавони, които са растителни химикали, имащи подобен на естроген ефект върху тялото [9]. По този начин ботаническите хранителни добавки с червена детелина се използват за лечение на симптомите на менопаузата и за поддържане или подобряване на сърдечно-съдовото здраве. Основните изофлавони на червената детелина са биоханин А, формононетин, ононин и сизотрин. При поглъщане на червена детелина биоханин А и формононетин се деметилират и метаболизират до генистеин и даидзеин в тялото [10].

Хмел (Humulus lupulus L.) са основната съставка, използвана за приготвяне на бира и традиционно се използва в Европа за улесняване на съня и намаляване на психическия стрес. Хмелът съдържа фитохимикали с широк спектър от биологични дейности, включително химиопрофилактични, кардиопротективни и противовъзпалителни ефекти [11]. Хранителните хранителни добавки са изследвани като ботанически алтернативи на хормоналната терапия за облекчаване на горещи вълни и свързани симптоми при жени в менопауза [12]. Основните компоненти на хмела са ксантохумол (халкон), изоксантохумол (флавон) и 8-пренилнарингенин (пренилиран флавоноид) [13, 14].

Въз основа на гореспоменатата информация очакваме, че комбинацията от екстракт от червена детелина и екстракт от хмел (RHEC) може да подобри различните симптоми на менопаузата. В това проучване ние изследваме ефектите на RHEC върху температурата на кожата на опашката (TST), серумния липиден профил, костния метаболизъм, антиоксиданта и маркерите на вазорелаксация, използвайки овариектомизиран модел (OVX), който показва спад в нивата на естроген, подобен на този в менопаузата Жени.

2. Материали и методи

2.1. Подготовка на RHEC

Червената детелина (листа) и хмелът (цветя и цветни пъпки), използвани в експеримента, са закупени от билков пазар (Danyang, Китай). Методът на екстракция е както следва: червената детелина (200 g) се екстрахира три пъти със 70% етанол (85 ° С и 3 h под обратен хладник). Екстрактът се филтрува през филтърна хартия и се концентрира при понижено налягане; концентратът се утаява при 4 ° С в продължение на 24 часа и след това утайката се суши. Хмелът (200 g) се екстрахира два пъти със 70% етанол (85 ° С и 4 часа кипене). Екстрактът се филтрува през филтърна хартия, концентрира се при понижено налягане и след това се суши. Екстрактите се смесват при тегловно съотношение 3: 1 и се използват за оценка на in vivo ефикасността.

2.2. Анализ на високоефективна течна хроматография (HPLC) на RHEC

Система от серия Agilent HPLC 1200, оборудвана с четвъртична помпа, автосамплер и детектор с фотодиодни решетки с колона Phenomenex® Luna C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) се използва за анализ (Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA). Елуирането с разтворител А (ацетонитрил) и разтворител В (0,25% мравчена киселина във вода) в градиентно елуиране при скорост на потока 1 ml/min се извършва, както следва: 0–3 min, 75% B; 3–33 мин, 75% –30% В; 33-40 минути, 30% -10% В; 40–45 мин, 10% В; 45–45,5 минути, 10% –75% В; и 45,5–50 минути, 75% В. Дължината на вълната на засичане беше зададена на 320 nm. Температурата на колоната се поддържа 30 ° С и инжекционният обем е 10 µL.

2.3. Животни и лечение
2.4. Измерване на TST

В деня на измерване на TST, носителят или RHEC се прилага орално 30 минути преди измерванията.

2.4.1. При природни условия

Плъховете бяха извадени от клетката и поставени на експериментална маса. След това само опашката беше леко задържана и температурата на гръбната част на опашката на около 2 см от основата беше измерена с помощта на инфрачервен термометър (Модел 153IRB, Bioseb, Chaville, Франция). След общо три измервания беше получена средната стойност.

2.4.2. При стресирани условия

TST при стресирани условия се измерва с леко модифициран метод, както беше описано по-рано [15]. Плъховете бяха задържани в държач в съзнателно състояние и TST беше измерен за 1 h от гръбната страна на опашката на около 2 cm от линията на козината с помощта на инфрачервен термометър. Преди тестването на всички животни беше позволено да се аклиматизират в лабораторията за 15 минути. Околната температура беше 25 ° C. Данните за TST се измерват на интервали от 10 минути през целия експериментален период.

2.5. Анализ на серума

Кръвните проби се центрофугират при 3000 rpm и 4 ° С в продължение на 15 минути; серумните проби бяха събрани и съхранявани при -70 ° C до анализ. Аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), алкална фосфатаза (ALP), общ холестерол (T-Chol), триглицерид (TG), холестерол с ниска плътност (LDL-C) и липопротеин с висока плътност (HDL-C) бяха измерени с помощта на автоматичен анализатор на химията на кръвта (BS-220, Mindray, Xuzhou City, Китай). Измерванията на остеокалцин, С-телопептид от тип I колаген (CTX-1), супероксиддисмутаза (SOD), малонил дехидрогеназа (MDA), ендотелин-1 и азотен оксид в серума бяха извършени с помощта на комплекта ELISA на плъх Osteocalcin (Cusabio Biotech, Хюстън, Тексас, САЩ), RatLaps (CTX-1) EIA анализ (имунодиагностична система, Gaithersburg, MD, САЩ), OxiSelect ™ супероксидна дисмутазна активност (Cell Biolabs, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ), OxiSelect ™ TBARS ( Комплект за анализ на тиобарбитурова киселина) (MDA Quantitation, Cell Biolabs Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ), комплект Quantikine ELISA Endothelin-1 (R&D Systems, Минеаполис, САЩ) и колориметричен NO тест комплект (R&D системи, Минеаполис, MN, USA), следвайки инструкциите на производителя. Всички проби бяха анализирани в два екземпляра в анализа.

2.6. Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, използвайки софтуер SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Повторната мярка се използва за статистически анализ на нивата на телесно тегло и TST във времето. Бяха извършени множество сравнения с тестовете на Дънкан за множество обхвати и корекцията на Tukey – Kramer. Резултатите са представени като средна стойност ± SD. Стойности на

се счита, че представляват статистическа значимост.

3. Резултати

3.1. HPLC анализ на RHEC

Въз основа на времето на абсорбция и задържане на стандартните материали, биоханин А и ксантохумол (Фигура 1 (а)) са идентифицирани като основни компоненти на RHEC и резултатите потвърждават, че RHEC съдържа 10,3 ± 0,9 mg/g биоханин А (25,4 минути) и 0,3 ± 0,04 mg/g ксантохумол (38,1 минути) (Фигура 1 (b)).

3.2. Тегло на тялото и мазнините

Промените в средното телесно тегло през експерименталния период са докладвани на Фигура 2. Групата OVX показва значително повишена промяна в теглото в сравнение с фалшивата група. Орално приложение на RHEC на овариектомирани плъхове в продължение на 12 седмици се наблюдава, за да инхибира увеличаването на телесното тегло през целия експериментален период. След 8 седмици приложение на RHEC при 500 mg/kg, има значително инхибиране на нарастването на телесното тегло. В допълнение, наддаването на телесно тегло беше значително намалено в края на експеримента във всички групи на лечение. Освен това, след приложението на RHCE, теглото на висцералната и ретроперитонеалната мастна тъкан са значително намалени в сравнение с това в OVX групата. Приемът на фураж в групата с OVX е значително по-висок, отколкото в групата с фалшиви, но значително намалява в групата със 120 mg/kg RHEC. Групите с 250 и 500 mg/kg RHEC също леко намаляват, но не се наблюдава значимост (Таблица 1).


3.3. Температура на кожата на опашката (TST)

Измерванията на TST при естествени условия през седмици 4, 8 и 12 са показани на фигура 3 (а), а подробни промени в TST на седмица 4 са показани на фигура 3 (б). OVX групата показа значително увеличение през целия експеримент в сравнение с фалшивата група. Увеличението на TST чрез овариектомия беше значително инхибирано от приложението на RTEC. В допълнение, при условията на стрес, групата OVX показа значително повишен TST на 20–60 минути след измерването (Фигура 3 (в)). Въпреки това, TST при плъхове RHEC (125, 250 или 500 mg/kg) е значително () по-нисък от този на групата OVX. В допълнение, по отношение на промяната на TST по време на 60 минути, температурата на OVX групата е значително по-висока от тази на фалшивата група и RHEC групите показват намален диапазон на TST по дозозависим начин (Фигура 3 (d) ).

3.4. Липиден профил

Групата OVX показва значително повишаване на общия холестерол, HDL-C и LDL-C. След 12 седмици на приложение на RHEC, общият холестерол значително намалява в групата с RHEC 500 mg/kg. Триглицеридите също намаляват във всички лекувани групи, макар и не значително (Таблица 2).

3.5. Биомаркери, свързани с костния метаболизъм

Серумният ALP, остеокалцинът и CTX-1 са значително увеличени в групата на OVX. Въпреки това, в групите, лекувани с RHEC, тези маркери показват модели на намаления в зависимост от дозата; CTX-1 в частност е значително намален в трите дозови групи (Таблица 2).

3.6. Капацитет на антиоксиданта

Групата OVX показва намаляване на нивото на SOD в серума и увеличаване на нивото на MDA в сравнение с фалшивата група (Таблица 2). Въпреки това, приложението на RHEC при 500 mg/kg за 12 седмици значително възстановява тези нива.

3.7. Промяна във Вазорелаксационните маркери

В групата на OVX плазменият ендотелин-1 е значително увеличен в сравнение с нивото в фалшивата група (Фигура 4 (а)), но азотният оксид е намален (Фигура 4 (б)). Тези промени обаче бяха значително нормализирани от прилагането на RHEC и показаха зависим от дозата резултат (Фигура 4).

3.8. Оценка на безопасността на RHEC

След 12 седмици на приложение на RHEC, телесното тегло на черния дроб и бъбреците (таблица 1) и серумните нива на ALT и AST (таблица 2) не показват никакви разлики. OVX плъховете показват атрофия на ендометриалните епителни клетки, а RHEC групите показват същите микроскопски находки като тези на OVX групата (Таблица 1 и Фигура 5); също така няма разлика в теглото на матката сред групите OVX и RHEC (Таблица 1).

4. Дискусия

Намереният в растенията естрогенен компонент се нарича фитоестроген, който присъства на особено високо ниво в Fabaceae. Той проявява активност, подобна на тази на естрогена и е предимно вещество от флавоноиди и фенолни киселини [16]. Един от най-изследваните фитоестрогени е изофлавонът. Изофлавоновият компонент на червената детелина се свързва с естрогенния рецептор и се съобщава, че значително облекчава намаляването на естрадиола, свързано с менопаузата при поглъщане с червена детелина [17, 18]. Ксантохумол, изоксантохумол и 8-пренилнарингенин (8-PN) в хмела са известни още като фитоестрогени [19]. Съобщава се, че екстрактите от червена детелина и хмел подобряват фрагментарните симптоми на менопаузата, като остеопороза и горещи вълни; тяхната ефективност обаче все още се обсъжда [20–22]. Въз основа на тази предишна работа, настоящото проучване е проведено за изследване на цялостното подобряване на симптомите на менопаузата при жените, като натрупване на телесни мазнини, горещи вълни, абнормни кръвни липиди, остеопороза и риск от ССЗ, от администрацията на RHEC при OVX плъхове.

Синергичният ефект на RHEC върху естрогенния рецептор е потвърден в предишното ни проучване (данни в процес на подаване) и в това проучване потвърдихме неговото подобряване на различни симптоми, свързани с дефицит на естроген, използвайки модел на плъхове с яйчници.

Подобно на доклад, описващ, че намаляването на секрецията на естроген чрез резекция на яйчниците причинява наддаване на тегло [23], теглото на тялото и мазнините на плъховете в групата на OVX са били по-високи от тези в бутафорната група. Прилагането на RHEC инхибира наддаването на тегло и натрупването на мазнини в корема и този ефект е подобен на този, наблюдаван след лечение с естроген при плъхове OVX [24]. Тази загуба на тегло не се наблюдава само при червената детелина [25]; загуба на тегло се наблюдава при високо съдържание на ксантохумол в хмела [26, 27]. Съдържанието на биоханин А и ксантохумол в RHEC е съответно приблизително 1,09% и 0,033%. Въпреки че RHEC показва сходно или по-ниско съдържание от активните съединения, споменати в предишни проучвания [25, 26], той показва инхибиране на наддаването на тегло и ефекти на натрупване на мазнини в корема. Тъй като вече потвърдихме ефектите на активността на естрогенните рецептори върху RHEC чрез тестове in vitro (данни в процес на подаване), този ефект се очаква да бъде чрез активността на естрогенните рецептори.

Естрогенният дефицит участва в развитието на сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) при жените и играе роля, наред с други, на ендотелната функция и съдовия тонус [32]. Newson [33] препоръчва ранна и активна профилактика и реакция за управление на сърдечно-съдови рискови фактори. Следователно, превенцията на сърдечно-съдовите рискови фактори се счита за един от основните показатели при оценка на ефикасността на RHEC. В това проучване се измерват нивата на TC, TG, HDL-C и LDL-C, свързани със сърдечно-съдови заболявания и нивата на ET-1 и NO се анализират в кръвта, за да се оцени ендотелната функция. Резултатите показват значително намаляване на T-Chol в групата на RHEC 500 mg/kg доза, заедно с тенденции за намаляване на нивата на TG и LDL-C. Тези резултати са подобни на тези, наблюдавани при дислипидемия поради намаляване на естрогена, което се облекчава чрез естроген-заместителна терапия [34]. Освен това се наблюдава, че RE и HE имат ефикасност, свързана с липидния метаболизъм. Клинично проучване съобщава, че нивата на TC и LDL-C намаляват по време на 3-месечния прием на RE [35] и че нивата на HDL-C се увеличават след 1 година на приложение [36]. Много изследвания също съобщават за връзка между менопаузалните състояния и повишените нива на липидите в кръвта [37].

Намалените нива на естроген в кръвта повишават антиоксидантния стрес [43] и тези промени са свързани с повишени климактерични симптоми и повишен риск от ССЗ [44]. В този експеримент беше потвърдено, че оксидативният стрес е намален от прилагането на RHEC. Антиоксидантната активност, дължаща се на червената детелина и НЕ, е докладвана като един от механизмите, чрез които приложението на RHEC облекчава симптомите на менопаузата [45, 46].

Повишаването на ендотелин-1 и намаляването на NO са представителни симптоми на ендотелната дисфункция, които се наблюдават и при жени с дефицит на естроген и яйчници. Естрогенната терапия може да предпази от този дисбаланс в ендотелната функция и да намали риска от ССЗ [47, 48]. В настоящото проучване ендотелната функция се нормализира чрез приложение на RHEC, подобно на случая с приложението на естроген; по този начин се очаква да има ефект на намаляване на риска от ССЗ след менопаузата. Освен това идентифицирахме синергичен ефект на компонентите на RHEC, използвайки HUVEC.