1 Катедра по кардиология, болница Jinshan на университета Fudan, Шанхай 201508, Китай

атеросклерозата

Резюме

1. Въведение

Атеросклерозата (АС) е водеща причина за хронична смърт в световен мащаб, а ендотелната дисфункция е първата стъпка към коронарната артериосклероза [1]. Ендотелните увреждания, натрупването на плака и тесните артерии в крайна сметка могат да доведат до коронарна болест на сърцето и инфаркт на миокарда [2]. Кръвната плака, състояща се от холестерол, мазнини и калций, е отговорна за ограничаването на притока на богата на кислород кръв към важни органи, особено сърцето и мозъка [3]. Азотният оксид (NO) се произвежда от синтази на азотен оксид (NOSs), които са свързани с ендотелни NOSs (eNOSs), невронни NOSs (nNOSs) и индуцируеми NOSs (iNOSs) [4]. Експресията на eNOS, която произвежда ниска концентрация на NO, е необходима за ендотелната функция и целостта [5]. Полученият от ендотел NO често се смята, че е защитен агент при различни заболявания и е замесен да играе защитна роля срещу AS чрез намаляване на оксидативния стрес, възпалението, пролиферацията и агрегацията на тромбоцитите [6–9].

L-аргининът, полусъществена аминокиселина, е основен за незрялост, заболявания и наранявания на човешкото тяло [10]. Като предшественик на NO, L-аргининът се метаболизира и регулира от сложен набор от ензими в няколко сигнални пътя [11]. Установено е, че сред тези ензими NOS е отговорен за метаболизирането на аргинин в NO и L-цитрулин [11]. Засиленият синтез или действие на NO води до вазодилатация и подобряване на клетъчния метаболизъм [12]. Доказателствата показват, че допълването на диетата с L-аргинин заедно със статин (аторвастатин) е по-ефективно за намаляване размера на лезията при AS, отколкото лечението или с L-аргинин, или само със статин [13].

MiRNAs, клас на силно консервативни некодиращи малки RNAs дълги 19-25 bp, са способни да дегенерират целевата mRNA и да потискат транслацията на mRNA чрез допълнително сдвояване на базата. Установено е, че двадесет и пет miRNAs са силно експресирани в човешки ендотелни клетки, от които miR-222/221 могат да регулират експресията на eNOS протеини [14]. Регулирането на eNOS протеини с тези miRNAs може да бъде от полза при лечението на AS; обаче дали L-аргинин може да подобри развитието на AS и основните молекулни механизми остават неясни. Целта на това проучване, използвайки модел на AS плъхове, индуциран от диета с високо съдържание на мазнини, е да се изследва ролята на L-аргинин в развитието на AS и механизмите, чрез които miR-221 може да повлияе на възможните сигнални пътища в ендотелните клетки по време на AS.

2. Материали и методи

2.1. Модел на животни

Проучванията върху животни бяха проведени с одобрението на етичната комисия за грижа за животните в болница Джиншан, Университет Фудан, Китай и в съответствие с насоките за експерименти с животни на Китайската академия на медицинските науки.

Осемседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (SD), закупени от Shanghai Jiesijie Laboratories Animal Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай), бяха разделени на случаен принцип в четири групи (н = 10 във всяка група). Плъховете бяха настанени в стандартна стая за животни с по четири животни във всяка клетка. Температурата се поддържа на 20 ± 2 ° C, относителната влажност на въздуха 60% и светлинният цикъл на 12 h/d.

Плъховете от контролната група (група 1) получават стандартна храна и питейна вода. Плъховете с високо съдържание на мазнини (група 2), групата за превенция (група 3) и групата, лекувана със статини (група 4), са хранени с диета с високо съдържание на мазнини, но група 2 не е получавала лечение. Плъховете от група 3 се инжектират с 1 g/kg/d L-аргинин (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) в продължение на 12 седмици по време на AS индукция. На плъховете от група 4 са прилагани 4 mg/kg/d симвастатин в продължение на 12 седмици, а на плъховете от групи 1 и 2 са инжектирани 2 ml физиологичен разтвор.

2.2. Морфология и хистология

Животните бяха анестезирани с 40 mg/kg телесно тегло 1% пентобарбитал чрез интраперитонеална инжекция и бяха умъртвени на 24-седмична възраст. Тъканта на аортата на корема се дисектира и изрязва между сърцето и бъбречната артерия, изплаква се със студен физиологичен разтвор и се фиксира в 10% разтвор на формалин за 24 часа. След това дисектираните тъкани се дехидратират чрез степенувана серия етанол, диафонизират се с ксилол и се вграждат с парапласт (Leica Biosystems, Wetzlar, Германия). След това хистологичните тъкани се нарязват на секции 5 µm с дебелина и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Останалите тъканни проби се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 ° C за по-нататъшно проучване. Напречните сечения на аортата се наблюдават под светлинен микроскоп. Дебелината на интимата и туниката е измерена с помощта на ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

2.3. Първично изолиране на ендотелни клетки и култура

Аортните артерии се дисектират в стерилна среда и се отварят с помощта на микроножици след отстраняване на мастните и съединителните тъкани. Интимата на артерията се потапя в малко количество колагеназа от тип I и се усвоява в продължение на 1 час. Ендотелните клетки бяха изолирани и събрани след дисоциация с използване на 0,1% трипсин и многократно центрофугиране при 1000 rpm. Отделените ендотелни клетки се култивират в пълна среда, съдържаща 20% серум (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Калифорния, САЩ) за 3-4 дни. Клетките бяха предадени на следващото поколение след достигане на 90% сливане. Използвахме първите три поколения ендотелни клетки за по-нататъшно проучване.

2.4. Лечение с L-аргинин в ендотелни клетки

Ендотелните клетки се разделят на контролни празни, окислени липопротеини с ниска плътност (OxLDL), 5 mM L-аргинин, 25 mM L-аргинин и 50 mM L-аргинин. С изключение на тези в контролната група, клетките във всички групи бяха третирани със 100 µg/mL OxLDL (Xie Sheng Biotechnology Company, Пекин, Китай) в среда с висока глюкоза. L-аргинин се прилага за всички, с изключение на контролната и OxLDL групи в продължение на 24 часа. След това всички клетки бяха събрани за по-нататъшно изследване.

2.5. Трансфекция на AntagormiRNA

AntagormiR-221 и miRNA с отрицателен контрол (miR-NC) са закупени от Гуанджоу RiboBio Co., Ltd. (Гуанджоу, Китай). Накратко, 50 nM antagormiR-221/miR-NC за ендотелни клетки се смесва със 7 μL/кладенче реагент за липфектамин 2000 в 2 ml среда без Opti-MEM без серум (Cat #: 31985070, GIBCO, Thermo Fisher Scientific). Клетките бяха трансфектирани в продължение на 6 часа и след това средата беше заместена и поддържана до 48 часа.

2.6. Западно петно

Тъканта на аортата на плъх и ендотелните клетки бяха събрани и подложени на разрушаване с помощта на ултразвуков хомогенизатор в RIPA, съдържащ инхибитори на протеаза и фосфатаза (Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd. Nanjing, China). Концентрациите на протеини бяха открити с помощта на набора за анализ на протеин Pierce BCA (Rockford, IL, USA). Двадесет микрограма протеин от клетките (8 μL за животински тъкани) се разделят върху 8% гелове за електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламид гел и се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид, който се блокира с използване на 5% обезмаслено мляко за 1 h при стайна температура. Протеиновите проби се инкубират цяла нощ с антитела, заек β-актин и заешки eNOS (Технология за клетъчна сигнализация, Бевърли, Масачузетс, САЩ). Вторичното антитяло, антирабитова имуноглобулинова G-хрянова пероксидаза (1: 5000), е закупено от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Сигналите бяха открити и анализирани с помощта на система за гелиране на гелове Tanon-4500 (Tanon Science and Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай).

2.7. Екстракция на РНК и количествена верижна реакция на полимераза в реално време
2.8. Анализ на клетъчна апоптоза

Апоптозата на ендотелните клетки се определя, като се използва тест за откриване на апоптоза на флуоресцеин изотиоцианат (FITC)/пропидиев йодид (PI) на анексин V (Thermo Fisher Scientific). Клетките се усвояват с трипсин без EDTA, промиват се два пъти със студен физиологичен разтвор, буфериран с фосфат, центрофугират се и след това се суспендират в 100 µL свързващ буфер. Следваща, 5 µL Анексин V-FITC и 5 µL PI разтвор за оцветяване се добавя към 100 µL-клетъчна суспензия и се инкубира при 37 ° С в продължение на 15 минути. Смесите се разреждат в 400 ° С µL свързващ буфер и се анализира в рамките на 1 час, като се използва сканиране на клетъчно сортиране, свързано с флуоресценция (FACScan, Becton Dickinson, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).

2.9. Статистически анализи

Данните от измерванията, съответстващи на нормалното разпределение, се описват със средната стойност (M) ± стандартна грешка (SD), иначе описана от медианата. Множество групи, които се подчиняват на нормално разпределение и имат хомогенност на дисперсията, се определят с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ. За сравнение между две групи, съответствие с нормалното разпределение и хомогенност на дисперсията е приложена корекция на Bonferroni, в противен случай е използван тестът на Kruskal-Wallis. Данните бяха анализирани с помощта на Stata 12.0 (https://www.statalist.org) и

се счита за статистически значима.

2.10. Пациент и обществено участие

В това проучване не са участвали пациенти.

3. Резултати

3.1. Морфология на тъканта на плъх аорта

Както е показано на Фигура 1, туниката на аортите на плъховете от празната група е гладка и съдържа малък брой колаген и гладкомускулни влакна, както и равномерно разпределени еластични влакна. Плъховете от групата с високо съдържание на мазнини и без намеса показват увеличен брой видими пенообразуващи клетки и калцификация на артериалната стена.

Плъховете в групите за превенция на L-аргинин и лекуваните със симвастатин също показват различна степен на AS лезии в артериалната стена; обаче броят на калцификационните лезии е значително по-нисък и степента на калциране е значително по-малка от тази в групата с високо съдържание на мазнини без намеса. Таблица 1 показва, че плъховете в групата с високо съдържание на мазнини без намеса са имали най-дебелата туника от всички тествани групи, което показва успешното установяване на модела на плъхове AS.