Принос от Ян Л. Бреслоу

контролира

Резюме

Липопротеиновата липаза (LPL), разположена върху капилярния ендотел на екстрахепаталните тъкани, катализира ограничаващата скоростта стъпка при хидролизата на триглицериди (TG) от циркулиращи хиломикрони и липопротеини с много ниска плътност (за прегледи, виж референции 1 и 2). Количествено, повечето LPL се намират в мастната тъкан (AT) и мускулите, където освободените свободни мастни киселини се поглъщат или съхраняват, или съответно окисляват (3). Предполага се, че относителните нива на LPL активност в AT и мускулите определят как мастните калории се разпределят към съхранение или използване и че дисбалансът в експресията на тъканите може да доведе до затлъстяване или загуба на тегло (4, 5). До появата на индуцирани мутантни мишки не са били налични експериментални системи за директно тестване на тази хипотеза.

Преди това сме генерирали LPL нокаутиращи мишки (6), както и трансгенни мишки, експресиращи човешки LPL изключително в мускулите (7). LPL-дефицитните мишки са нормални при раждането, но развиват смъртоносна хипертриглицеридемия през първия ден от живота, след което значително намаляват вътреклетъчните липидни запаси. Трансгенните мишки, които експресират високи нива на човешки LPL в мускулите, показват повишени концентрации на свободни мастни киселини в мускулите и увеличен брой органели, метаболизиращи мастни киселини (митохондрии и пероксизоми). Заедно тези наблюдения предполагат, че експресията на LPL в тъканите е основен определящ фактор за навлизането на мастни киселини в клетките. За съжаление, предишните проучвания не можаха да отговорят на въпроси относно дългосрочните метаболитни последици за гостоприемника на променената тъканна експресия на LPL. Смъртта на новородените при нокаутираните мишки изключва изследването на натрупване на липиди в тъканите при здрави възрастни животни. Трансгенните мишки, експресиращи високи нива на човешки LPL, отслабват, но развиват миопатия и умират. Тяхното заболяване изключи категорични твърдения за последиците от разпределението на калориите между мазнините и мускулите за състава на телесната маса (BMC).

В настоящото проучване спасихме LPL нокаутната черта чрез размножаване в сравнително слабо експресиращ мускулно специфичен човешки LPL трансген от линия, която не е развила миопатия. Схемата за размножаване ни позволи да сравним мишки от див тип (L2) с приятели, които съдържат специфичния за мускулите трансген и две (L2-MCK) или никакви (L0-MCK) функционални копия на ендогенния LPL ген (MCK, миша креатин киназа ). Оценяват се и ефектите от тези генотипове върху фона на заболелите от затлъстяване об/об. Сравненията на L2 с L0-MCK мишки показват, че макар AT LPL да не е от съществено значение за развитието на мастната тъкан, се забелязват изразени качествени и количествени (на фона на ob/ob) разлики в мастните запаси при неговото отсъствие. Чрез сравняване на L2 с мишките L2-MCK е доказано, че относителната свръхекспресия на LPL в мускулите има метаболитни последици, потвърждавайки, че относителните нива на мускулите и AT LPL са физиологично важни.

МЕТОДИ

Поколение на индуцирани мутантни мишки от див тип и на фона на ob/ob.

Стратегията за отглеждане за получаване на мишки с дефицит на AT LPL включва две кръстоски. Първо, LPL хетерозиготни нокаутиращи мишки (mL1) и трансгенни мишки, експресиращи човешки LPL (hLPL) изключително в скелетния и сърдечния мускул под контрола на мишкия промотор на MCK [MCK-L (нисък експресор), преименуван на mL2/MCK-hLPL], бяха кръстосани за добив хетерозиготни нокаутиращи животни, които съдържат специфичния за мускулите човешки трансген (mL1/MCK-hLPL). След това те бяха кръстосани на mL1 мишки, за да се получат следните отпадъци за изследване (Таблица 1): mL2 мишки (преименувани на L2), съдържащи две функционални копия на миши LPL ген (mLPL) без трансген, mL2/MCK-hLPL мишки (преименувани на L2 -MCK), съдържащи две функционални копия на MLPL плюс специфичния за мускулите hLPL трансген и мишки mL0/MCK-hLPL (преименувани на L0-MCK), не съдържащи функционални копия на MLPL с hLPL експресия на трансген само в мускулите. Активността на LPL на тъканите се измерва в захранено състояние (8 ч. Сутринта), както е описано (7). Активността на скелетните мускули при мишки L2, L2-MCK и L0-MCK е 1,4 ± 0,5, 9,3 ± 1,4 (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Обобщение на генотиповете

За генериране и оценка на ефектите от дефицит на AT LPL върху фенотипа ob/ob, мишките L0-MCK, отглеждани като хомозиготни за трансген MCK-hLPL, бяха кръстосани с женски сурогати, трансплантирани с яйцеклетки от ob/ob мишки (The Jackson Laboratories). Всички потомци бяха хетерозиготни за LPL нокаут, MCG-hLPL трансген и ob. След това тези мишки бяха кръстосани, за да произведат ob/ob мъжки мишки, които съдържаха трансген MCK-hLPL и бяха или хомозиготен див тип (L2-MCK-ob/ob), или нокаут (L0-MCK-ob/ob) в локуса на LPL ( Маса 1). Генотиповете бяха определени при LPL на мишка, трансген MCK-hLPL и локусите, както е описано по-рано (6, 7). Всички мишки бяха настанени в специфична среда, свободна от патогени.

Криви на растежа.

Мишките от различни генотипове се отбиват на 3 седмици и след това се поддържат на чау диета (4,5% мазнини) и се претеглят седмично.

BMC се извършва, както е описано (5). Накратко, мишките на 4 месеца (фон от див тип) и 7-месеци (фон на фона на об/ob) бяха убити от дислокация на шийката на матката и претеглени (мокро тегло). За да се отстрани цялата телесна вода, труповете се поставят в конвекционна фурна 90 ° C, докато се наблюдава постоянна маса. Общото водно съдържание се изчислява като тегло на трупа преди фурната минус теглото на трупа след фурната (сухо тегло). Труповете бяха замразени за кратко в течен азот и хомогенизирани в блендер. Аликвотни части от един грам хомогенат се екстрахират в продължение на 3 часа с хлороформ/метанол (3: 1) в апарат за екстракция на Soxhlet за отстраняване на липиди. Останалите твърди вещества се сушат през нощта при стайна температура и се претеглят. Липидът се изчислява като тегло на пробата преди екстракция минус теглото на пробата след екстракцията. След това се изчислява общия телесен липид като липид в аликвотна част на сух труп, умножен по общо тегло на сух труп. Чистата телесна маса се изчислява като тегло преди дехидратация (мокро тегло) минус общото тегло на липидите и водата. Всички проби са направени в два екземпляра.

Хистологичен анализ.

След 20 часа живот, малките бяха обезглавени и кръвта и върховете на опашката бяха отстранени, съответно за плазмен и ДНК анализ. След това се изрязват различни тъкани и се подготвят за анализ. За оцветяване с маслено червено O животните са сагитално наполовина. Една част е вградена в Tissue Tek върху коркова плоча, замразена в 5-метилбутан (Merck) и предварително охладена в течен азот. След това срезовете с дебелина четири микрометра бяха изрязани и оцветени с маслено червено О. Останалата половина беше фиксирана с формалин и вградена в парафин по конвенционални техники и оцветена или с хематоксилин-еозин, масон-трихром или периодична киселина Schiff.

Анализ на състава на мастните киселини.

Съставът на мастните киселини на диетата, епидидималната AT и плазмата се извършват, както е описано (8). Накратко, след добавяне на С17: 0 TG на мастна киселина, холестеролов естер и фосфолипидни вътрешни стандарти (Nu Check Prep, Elysian, MN и Sigma), общият липид незабавно се екстрахира с разтворител Folch. Липидните фракции се разделят чрез TLC, като се използват силикагел G плочи и система от разтворители от хексан/диетилов етер/ледена оцетна киселина, 60: 40: 1. Плочата се напръсква с Rhodamine G и се визуализира с UV светлина. Интересуващите ленти се изстъргват в епруветки, съдържащи 2 ml 5% метанолна солна киселина. Епруветките се затварят с азот, загряват се при 70 ° С в продължение на 2 часа и се охлаждат. Метиловият естер на мастната киселина се екстрахира с хексан след добавяне на вода и се пуска на програмиран температурен газов хроматограф (модел 5890; Hewlett-Packard), снабден с пламъчен йонизационен детектор и 100 m × 0,25 mm SP2560 капилярна колона от силициев диоксид ( Supelco), както е описано (8). Идентифицирани са 43 пика, съответстващи на мастни киселини 10: 0 до 22: 6n-3, и тегловният процент за всяка мастна киселина е изчислен.

РЕЗУЛТАТИ

Криви на растежа. На 3-седмична възраст мишки с различни генотипове се отбиват на диета с чау (4,5% мазнини) и след това се претеглят седмично. (A) Мъж L2 (×, n = 5), L2-MCK (○, n = 8) и L0-MCK (▪, n = 6) мишки. (B) женски L2 (×,n = 7), L2-MCK (○, n = 8) и L0-MCK (▪, n = 10) мишки. (C) L2-MCK-ob/ob (□, n = 20) и L0-MCK-ob/ob (▪, n = 16) мишки. Стойностите представляват средни стойности ± SD. a, P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

BMC на трансгенни и контролни мишки

Нормалният BMC и брутният външен вид на AT при възрастни L0-MCK мишки бяха неочаквани с оглед на критичната роля на LPL в усвояването и съхраняването на AT мастни киселини. В нашето предишно проучване (6), L2 и LPL нокаутиращите (L0) мишки са имали малко или никакво AT при раждане (цезарово сечение), но до 20 h възраст мишките L2 са имали мастни запаси, докато L0 мишките не са. В настоящото проучване мишките L2, L0-MCK, L2-MCK и L0 съдържат само следи от мастни запаси при раждането (данните не са показани). Обаче, както е показано на фиг. 2 вляво (увеличение от 70 пъти) от представителни участъци от перигландуларен AT, на 20-годишна възраст всички мишки освен L0 са имали адекватни AT на това и други места. Внимателното хистологично изследване (фиг. 2 вдясно, увеличение с размери 270) разкрива относително хомогенни, големи, невакуолирани адипоцити при L2 мишки, докато мишките L0-MCK и L2-MCK имат повишена морфологична хетерогенност с появата на много плуривакулирани адипоцити и намаляване на големите едновакулирани клетки. По този начин изглежда, че при нормален фон дефицитът на AT LPL има ефект върху клетъчната морфология, но не предотвратява натрупването на AT и животните могат да компенсират дефицита дори на 20-годишна възраст.

Хистологичен анализ на AT. Типични перигландуларни AT от (A) L2, (B) L0-MCK, (C) L2-MCK и (D) L0 малки на 20 часа живот. (Отляво, × 70 увеличение; Отдясно, × 270 увеличение, фокусирано само върху AT.) Gl, жлезист епител; В, мастна тъкан.

След това се оценява интрамускулно натрупване на липиди с различни количества експресия на LPL в мускулите със и без експресия на AT LPL. Извършва се светлинна микроскопия на мускулни секции от 20-годишни малки L2, L2-MCK, L0-MCK и L0 и съдържанието на интрамускулни липиди се оценява полуколичествено (Фиг. 3). В сравнение с мускулите от мишки L2, мишките L2-MCK са имали леко (10–20%), докато мишките L0-MCK са имали значително (60%) повишено ниво на липидите. Както беше съобщено по-рано, L0 мишки почти нямаха интрамускулен липид. По този начин отсъствието на AT LPL, повече от общата активност на LPL на мускулите, определя натрупването на мускулни липиди.

Полуколичествен анализ на интрамускулни липидни капчици. Полуколичественият анализ на интрамускулния липид се извършва „на сляпо“ (без да се знае генотип), като се оценяват хистологичните разрези от едно (най-малко) до пет (най-голямо) в зависимост от количеството вътреклетъчни липидни капчици. След това стойностите бяха осреднени за всеки генотип. Числата в скоби означават броя на малките, анализирани за всеки генотип.

След това се сравняват брутните изяви на AT при L2-MCK-ob/ob и L0-MCK-ob/ob мишки (Фиг. 4). Съвместим с намаляването на теглото и липидната маса, има брутно намаление на периреналната и гонадната AT при мишки L0-MCK-ob/ob, както и на други места (данните не са показани). AT също изглеждаше кафяв с повишена съдова, а не бял цвят. По този начин при генетично програмирано затлъстяване липсата на AT LPL възпрепятства натрупването на липиди в мастните запаси.

Брутен външен вид на ob/ob мишки с дефицит на AT LPL. L2-MCK-ob/ob (ляво) и L0-MCK-ob/ob (дясно) мишки и тъкани бяха сравнени. (А) Типични мъжки кученца на 7 месеца. Отбелязват се телесни тегла. (Б) Периренални и ретроперитонеални мастни депа. К, бъбрек; В, мастна тъкан. (В) Гонадни мазнини. Т, тестиси.

Среден състав на мастните киселини на диетата и AT

ДИСКУСИЯ

AT масата се поддържа точно, дори когато основният субстрат за синтеза на AT TG, екзогенна мастна киселина, е лишен. По този начин компенсаторните механизми трябва да са се развили, за да запазят мастните запаси. Тези резервни процеси се контролират фино и при възрастни животни водят до нормални мастни запаси и, както се оценява от нивата на лептинов плазмен (данните не са показани), мастна функция. Процесът започва в началото на живота с качествено нормално АТ, развиващо се след раждането и налично до 20 часа възраст. Това предполага, че поддържането на AT маса е от съществено значение за оцеляването на организма. Интересното е, че повишената AT липогенеза също е описана наскоро при плъхове, претърпели няколко цикъла на гладуване и повторно хранене, което отново осигурява потенциално предимство за оцеляване (18). Контролът за този процес, независимо дали е централен или локален, трябва да бъде изяснен.

Свръхекспресията на LPL в мускулите може да доведе до кражба на субстрат на мастна киселина далеч от AT, но не води до намаляване на мастната маса поради ендогенна биосинтеза на мастни киселини. Greenwood (4, 5) предполага, че относителната свръхекспресия на AT в сравнение с мускулната LPL поражда затлъстяване. Това се заключава от проучвания при гризачи и хора, показващи относителна свръхекспресия на AT LPL при условия на затлъстяване (19). Механично се предполага, че кражбата на субстрат от AT или е причинила директно натрупване на мазнини, или чрез лишаване на други тъкани от калории, получени от мазнини, води до повишен апетит и прекомерна консумация на калории. В настоящото проучване не генерирахме мишки с повишен AT към мускулна LPL; по-скоро генерирахме обратното. При тези животни (L2-MCK) наистина има доказателства за кражба на субстрат от мускулите, но компенсаторното увеличаване на ендогенния синтез на мастни киселини в AT предотвратява промени в BMC или приема на храна. В момента се генерират животни с повишено съотношение на AT към мускулна LPL активност, за да се тества директно хипотезата на Greenwood. Настоящите експерименти обаче показват, че при нормални мишки основната промяна в съотношението на мускулната активност към активността на AT LPL сама по себе си не променя наддаването на тегло или консумацията на храна.

При ob/ob мишките липсата на AT LPL, особено при по-възрастните мишки, е свързана с изравняване на кривата на наддаване на тегло и по-малко мастна маса, отколкото при мишки, където AT LPL присъства. При условия на повишен прием на храна и намален метаболизъм, които съществуват при ob/ob мишки (19–21), AT LPL-дефицитните мишки наддават повече тегло от нормалните мишки, но по-малко от ob/ob мишките с нормален AT LPL. Най-простото обяснение е, че ендогенният синтез на AT мастни киселини може да продължи до определен момент, но достига известна граница. Съдейки по платото в кривата на наддаване на тегло при мишки L0-MCK-ob/ob след 90 дни се постига стабилно състояние с пътища на синтез и отстраняване в баланс. Тези данни предполагат, че в някои случаи количеството на AT LPL може да бъде ограничаващо при развитието на затлъстяване.

В обобщение, докладваните индуцирани мутантни мишки разкриват фундаментална роля за LPL в навлизането на калории, получени от мазнини, но също така посочват важни резервни пътища, които вероятно са необходими за оцеляването на организма.