Резюме

Таблица 1. Характеристики на пациентите със синдром на Wiskott-Aldrich.

синдром

Вземане на кръв и изолиране на тромбоцити

Изследванията бяха извършени в съответствие с Декларацията от Хелзинки с одобрението на Етичния комитет на Детския център по хематология и бе получено писмено информирано съгласие от всички пациенти (или техните родители) и донори. Измитите тромбоцити се приготвят по същество, както е описано по-горе

Експерименти с конфокална микроскопия: общ дизайн

Стъклените покривни стъкла се почистват и покриват с 1 mg/ml фибриноген или монафрам във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Измитите тромбоцити бяха прикрепени към покритата с протеин повърхност чрез инкубиране при 1.3 × 10/μL (или максималната концентрация, постижима за WAS при условия на тромбоцитопения) в продължение на 20 минути и изплакване с буфер А с 1.5 mM CaCl2. Фракцията на PS се отчита след инкубация за още 30 минути.

Цитозолна калциева сигнализация и потенциал на митохондриалната мембрана се променят

Методологията за тези изследвания беше по същество, както е описана другаде.18 Калибрирането за рациометрични измервания се извършва отделно за здрави и WAS тромбоцити. Концентрациите на калций се изчисляват, като се използва уравнение за съотношениеметрични показатели.

Характеризиране на отговора на тромбоцитите към TRAP-6 в богата на тромбоцити плазма

Проби от богата на тромбоцити плазма се разреждат с бедна на тромбоцити плазма до крайна концентрация 20 000/ml и се буферират с HEPES при рН 7,4 (100 μM крайна концентрация). Необратимият тромбинов инхибитор Phe-Pro-Arg хлорометил кетон (PPACK) се добавя към крайната концентрация от 100 μM, за да се блокира спонтанното генериране на тромбин при повторно калцифициране. Тромбоцитите се рекалцифицират чрез добавяне на калциев хлорид (крайна концентрация 20 тМ, което съответства на 2 тМ свободен калций 20) и се активират от 25 цМ TRAP-6 (агонист на тромбиновия рецептор пептид-6) за 5 минути при стайна температура.

Измерване на АТФ в тромбоцитите

Накратко, тромбоцитите от пробите се лизират (чрез добавяне на 90 μL диметилсулфоксид към 10 μL суспензия на тромбоцити) и се анализират чрез анализ на луцифераза-луциферин, както е описано по-рано 2221, докато другата част се оцветява с CD61-FITC и анексин V-Alexa Fluor 647 и анализиран чрез поточна цитометрия.

Характеризиране на поточната цитометрия на функционалната активност на тромбоцитите

Експериментите са извършени по същество, както е описано по-рано2423 с малки модификации.

Трансмисионна електронна микроскопия

Протоколът беше по същество както е описано другаде

Статистика

Данните са представени като средни стойности ± стандартни отклонения. Статистическата значимост на разликите между групите е определена с непараметричния U-тест на Mann-Whitney (P) или Wilcoxon с признат ранг (P *) за сдвоени проби. Разликите се считат за статистически значими, когато P-стойността е

Фигура 1. Излагане на фосфатидилсерин от тромбоцити на синдрома на Wiskott-Aldrich при свързване на фибриноген. (А) Конфокални микроскопични изображения на здрави (вляво) и синдром на Wiskott-Aldrich (WAS) (вдясно) тромбоцити след разпространение в продължение на 30 минути върху фибриногенова повърхност в присъствието на 1,5 μM Ca2 +. Тромбоцитите са маркирани с CD61 (зелен) и анексин V (червен); скала: 10 μm. (B) Фосфатидилсерин-положителна (PS +) фракция на тромбоцитите от пациенти с WAS (27 пациенти,> 7500 клетки), здрави възрастни (18 донори,> 6500 клетки) и 0- до 7-годишни деца без WAS (6 деца, възраст: 0, 0, 2, 3, 4, 7 години, 2300 тромбоцити) върху фибриногенова повърхност. (C) PS + фракция на WAS тромбоцити на фибриногеновата повърхност, показваща сравнение на лекувани с romiplostim и нелекувани пациенти с WAS, P = 0.94. (D) Покрити с покритие Monafram не променят фракцията PS +, P = 0,86, n = 4, 2 500 тромбоцити. без/без: без; FG: фибриноген.

Функционална активност на тромбоцитите на синдрома на Wiskott-Aldrich

Фигура 2. Функционален отговор на синдрома на Wiskott-Aldrich и здрави тромбоцити. (A-G) Тромбоцитите от цяла кръв се стимулират (обозначени с A) или не (обозначени като N/A) с агонист на тромбиновия рецептор пептид-6 плюс свързан с колаген пептид и се анализират чрез поточна цитометрия. Показаните параметри за здрави деца (n = 21, възраст 0-13 години, медиана 5,0) и пациенти с Wiskott-Aldrich (17 лекувани с ромиплостим, 11 нелекувани) са: размер на тромбоцитите, определен от разсейването напред, измерен със средната интензивност на флуоресценция (MFI) (A); Ниво CD42b, MFI (B); CD61 ниво, MFI (C); PAC1-положителни тромбоцити,% (D); CD62p-положителни тромбоцити,% (E); освобождаване на плътни гранули, определено от нивото на мепакрин, MFI (F); и фосфатидилсерин-положителна фракция на тромбоцитите,% (G). P: U-тест на Mann-Whitney, P *: тест на Wilcoxon с ранг. FSC: разсейване напред, WAS: синдром на Wiskott-Aldrich; PS +: фосфатидилсерин-позитивен.

Сигнални събития в единични прикрепени към фибриноген тромбоцити на синдром на Wiskott-Aldrich

За да идентифицираме механизмите на PS екстернализацията на WAS тромбоцитите, ние едновременно изследвахме динамиката на калция в цитозола, митохондриалния мембранен потенциал и експозицията на PS в WAS и контролните тромбоцити (Фигура 3). Средното вътреклетъчно ниво на цитозолен калций в WAS тромбоцитите е 4 пъти по-голямо от това в контролните тромбоцити в началото и средната разлика се увеличава с времето (Фигура 3А). Докато здравите нестимулирани тромбоцити, в съответствие с предишни доклади, 3218 са имали само случайни скокове на калций, когато са свързани с фибриноген (Фигура 3B), нестимулираните тромбоцити от пациенти с WAS са имали чести трептения с по-голяма продължителност на скокове (Фигура 3C, D) Митохондриите в WAS тромбоцитите губят своя мембранен потенциал един след друг и, ако всички те станат TMRM-отрицателни, клетката започва да се свързва с анексин V в рамките на 10 s (Фигура 3D), точно както е съобщено преди за образуването на PS тромбоцити, индуцирано в здрави донори с TRAP-6 или тромбин.2718 Това е в съгласие със сценария на индуцирана от митохондриална претоварване с калций некроза на образуването на прокоагулантни тромбоцити.

Фигура 3. Динамика на цитоплазмен калций, митохондриални потенциали и експозиция на фосфатидилсерин на единични тромбоцити. Графиките показват динамика на вътреклетъчната концентрация на калций и свързване в приложение V в единични тромбоцити по време на инкубация върху фибриноген в присъствието на 1,5 mM извънклетъчен калций. (A) Средна калциева динамика (± стандартно отклонение) за неактивирани (N/A) тромбоцити от пациенти със синдром на Wiskott-Aldrich (WAS) (4 пациенти, 34 тромбоцити) и за тромбоцити от здрави донори (HD), които са или активиран с 10 μM TRAP (3 HD, 30 тромбоцити) или неактивиран (3 HD, 26 тромбоцити). (Б) Динамика за единичен здрав фосфатидилсерин-отрицателен (PS -) тромбоцит; (C) същото за WAS PS - тромбоцит; (D) същото за WAS PS + тромбоцит. Сигналът TMRM е представен като брой TMRM-положителни митохондрии в тромбоцитите (B-D). Вътреклетъчни събития, водещи до експозиция на PS, индуцирана с колапс на митохондриите с последващо увеличение на цитоплазматичния калций и експозиция на PS. И трите процеса бяха почти едновременни и продължиха десетилетия от секунди. Както WAS (E), така и нормалните (не показани) PS + тромбоцити загубиха своите митохондриални потенциали. Скала: 1 μm за всички микроскопични изображения. TRAP: пептид агонист на тромбинов рецептор; TMRM: тетраметилродамин метилов естер.

Важното е, че изобразяването на интервали от време разкрива, че митохондриалният колапс в WAS тромбоцитите с малко митохондрии от своя страна води до бързо повишаване на цитозолния калций (Допълнителна онлайн фигура S3A, времева точка 116 s). Ако беше обърната, концентрацията на калций също намалява (Допълнителна онлайн фигура S3A, времева точка 146 s). Това е драстично различно от активираните тромбоцити на здрави донори, при които калцият не е толкова чувствителен към колапса на единична митохондрия.18 Интересното е, че WAS тромбоцитите с голям брой митохондрии имат повишен фонов цитозолен калций и чести трептения, но не са чувствителни към колапс на единични митохондрии (допълнителна онлайн фигура S3B).

Излагането на фосфатидилсерин върху тромбоцитите със синдром на Wiskott-Aldrich се медиира от митохондриалната пропускливост на отваряне на порите

Критичният елемент на митохондриално задвижваната некроза е отварянето на порите за преход на митохондриалната пропускливост. За да проверим това, добавихме няколко инхибитора на различни сигнални пътища за регулиране на клетъчната смърт по време на инкубация на тромбоцитите върху фибриноген (циклоспорин А, некростатин-1, Z-VAD-FMK) или разпространение (калпептин). Инхибиторът на преходните пори на митохондриалната пропускливост циклоспорин А (5 μM) значително намалява PS фракцията, образувана от WAS тромбоцитите върху фибриноген (Фигура 4А). Други инхибитори, включително инхибитор на некроптоза некростатин-1, инхибитор на калпаин калпептин и инхибитор на пан-каспаза Z-VAD-FMK, не са имали значителен ефект върху експозицията на PS (Фигура 4В). Тези данни категорично подсказват, че некротичният механизъм на митохондриалната пропускливост при отваряне на порите е отговорен за повишената експозиция на PS в тромбоцитите.

Роля на калциевата хомеостаза, клетъчната енергетика и реактивните кислородни видове при излагане на фосфатидилсерин от тромбоцити на синдром на Wiskott-Aldrich

За да се получи по-нататъшна представа за некрозата на прикрепените към повърхността WAS тромбоцити, те са били третирани с ксестоспонгин С (блокер на инозитол трисфосфатни рецептори) или тапсигаргин (инхибитор на сарко-ендоплазмен ретикулум Са АТРаза) или в буфер А без добавка на калциев хлорид (Фигура 4С). Ксестоспонгин С инхибира експозицията на PS, което предполага участие на сигнализиране на инозитол трисфосфат, докато тапсигаргин мощно усилва некрозата на тромбоцитите. За разлика от това, ефектите са драстично намалени при липса на извънклетъчен калций.

Некрозата на тромбоцитите корелира директно с броя на митохондриите

Симулациите на системна биология разкриват критичната роля на митохондриалния брой и съотношението повърхност/обем при програмирана клетъчна смърт при синдром на Wiskott-Aldrich

За да анализираме механизмите на митохондрийно-зависимата некроза в WAS, разработихме изчислителен модел на биологичен модел на калциевата сигнализация (Фигура 6). В модела, който включваше всички отделения и основните механизми за сигнализиране на калций, ние изследвахме зависимостта на тромбоцитната реакция на калций от две основни променливи, които се различават за WAS тромбоцитите, броя на митохондриите и размера на тромбоцитите.

Фигура 6. Повишен цитозолен калций в резултат на намаляване: компютърна система биология симулация на калциева сигнализация при нормални и синдром на Wiskott-Aldrich тромбоцити Предполага се, че тромбоцитите на синдром на Wiskott-Aldrich (WAS) имат същото съдържание на сигнални протеини, мащабирани до съответния обем на отделенията. (A, B) Стохастична симулация на активирането на нормални тромбоцити, съдържащи два (A) или четири (B) митохондрии с 10 nM тромбин. С колапса на една митохондрия средният цитозолен калций се увеличава 1,5 пъти (А) в случай на две митохондрии или не се променя (В) в случай на четири митохондрии. (C-E) Стохастични и детерминистични симулации на нормални и WAS тромбоцити, стимулирани с 1 nM тромбин.

Моделът демонстрира, че намаляването на броя на митохондриите трябва да направи тромбоцитите по-чувствителни към митохондриален колапс и да доведе до по-голямо увеличение на калция, тъй като останалите митохондрии не могат да понесат натоварването от производството на АТФ (Фигура 6А, В), което е в съгласие с експериментални наблюдения. Също така симулирахме тромбоцити с различни размери; при скалирането им съотношението между повърхностните и обемните молекули е естествено променено (Фигура 6), тъй като обемът е пропорционален на размера до третата степен, докато повърхността е пропорционална на размера на втората степен. При стимулация виртуалните тромбоцити с по-малък размер имат сравнима активна фосфолипаза С на обем (Фигура 6С), но повече инозитол трисфосфат и в крайна сметка много повече калций (Фигура 6Е), тъй като имат повече инозитол трисфосфатни рецептори на обем (както се предполага, че да бъдат пропорционални на повърхността). Това отново е в съответствие с експерименталните данни, представени по-горе, които показват повишени нива на калций в WAS дори преди митохондриалната пропускливост при отваряне на порите и с чувствителността на явлението към ксестоспонгин С.

Следователно моделът прогнозира, че размерът на тромбоцитите при нелекувани пациенти с WAS ще повлияе отрицателно върху способността на тромбоцитите да изложат PS спонтанно и (ако това е механизмът, лежащ в основата на тромбоцитопенията) ще повлияе положително върху броя на тромбоцитите на пациентите. Интересното е, че е налице значителна положителна корелация между размера на тромбоцитите и броя на тромбоцитите сред нелекуваните пациенти с WAS (допълнителна онлайн фигура S7A). Въпреки че не наблюдавахме значителни корелации с експозицията на PS, вероятно в резултат на ограничения брой проби (допълнителна онлайн фигура S7B, C), интересно е, че пациент # 18 (обозначен с червена стрелка), който е с нормални размери тромбоцити и лек фенотип, също са имали най-малко експозиция на PS при имобилизация и случайно най-висок брой тромбоцити.

Дискусия

Изследваните в настоящото проучване феномени се съгласяват добре с предишни наблюдения на Shcherbina et al. 1110, които съобщават за увеличена, ускорена или спонтанна експозиция на PS от тромбоцитите на пациенти с WAS или WAS нокаутирани мишки, свързани с повишени нива на калций в покой, и осигуряват молекулярна основа за предишните доклади. Механизмът на тази масивна експозиция на PS в тромбоцитите WAS изглежда по същество подобен на този, определящ образуването на прокоагулантни тромбоцити, предизвикано от агонист, при физиологично мощно активиране на тромбоцитите: 373634332618 увеличаване на цитозолния калций, последвано от претоварване и колапс на митохондриалния калций, което в крайна сметка води до некротична клетъчна смърт . Разликата е, че експозицията на PS при WAS се предизвиква от слаби стимули, като прикрепването на фибриноген, който, макар и признат за активиращ стимул, 38 сам по себе си води до незначителна експозиция на PS при здрави донорски тромбоцити. Високият процент на тромбоцитите в PS изглежда е универсална характеристика на заболяването, независимо от неговата тежест и отсъствие \ наличие на други WAS характеристики.

Сходството между тези явления (излагане на PS от нормални тромбоцити чрез тромбин и/или рецептори на колаген и излагане на PS от WAS тромбоцити, индуцирано от прикрепването на фибриноген) стига дотам, че феноменът на преобладаваща некроза от тромбоцити с по-малко митохондрии се наблюдава тук за TRAP-6 - или стимулирано от тромбин активиране на здрави тромбоцити. Това е интересно само по себе си и може да има последици извън обхвата на настоящото проучване: въпреки че няколко предишни проучвания се опитват да идентифицират свойствата на тромбоцитите, които ги предразполагат към образуване на прокоагуланти като възраст или концентрация на калций в покой, 393318 ефектите са много по-малки от тези на броя на митохондриите и като цяло се приема, че е неясно кои тромбоцити стават некротични и кои не.