Катедра по клинично хранене, Немски институт по човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: Н. Н. Рудович, Германски институт за човешко хранене Потсдам, Arthur-Scheunert-Street 114-116, 14558 Nuthetal, Германия (имейл: [имейл защитен]).

Катедра по молекулярна физиология, Институт по молекулярна физиология на растенията Макс Планк, Потсдам-Голм;

Катедра по вътрешни болести II, Klinikum Innenstadt, Университет Лудвигс-Максимилианс в Мюнхен;

Катедра по клинично хранене, Немски институт по човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Катедра по клинично хранене, Немски институт по човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Катедра по приложен метаболомен анализ, Институт по молекулярна физиология на растенията Макс Планк, Потсдам-Голм;

Катедра по клинично хранене, Немски институт по човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Катедра по клинично хранене, Немски институт по човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Университетски болници Ковънтри и Уорикшир NHS Trust, Ковънтри и Изследователски институт за клинични науки, Университет в Уорик, Уорик, Великобритания; и

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Катедра по медицина, Институт по метаболитни заболявания, Университет в Синсинати, Синсинати, Охайо

Катедра по молекулярна физиология, Институт по молекулярна физиология на растенията Макс Планк, Потсдам-Голм;

Катедра по приложен метаболомен анализ, Институт по молекулярна физиология на растенията Макс Планк, Потсдам-Голм;

Център за диабет Бад Лаутерберг, Бад Лаутерберг, Германия;

Катедра по клинично хранене, Немски институт за човешко хранене, Потсдам;

Катедра по ендокринология, диабет и хранене, Campus Benjamin Franklin, Charité University Medicine, Берлин;

Резюме

Последните данни показват, че орексигенният ефект на грелин може да бъде повлиян и от други стомашно-чревни пептиди като холецистокин (CCK), бомбезин, пептид YY3–36 (PYY3–36) и глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1), което предполага релевантни кръстосани разговори между периферните орексигенични и анорексигенни сигнали при контрола на апетита и телесното тегло (49).

Инкретин-глюкозозависимият инсулинотропен полипептид (GIP), друг зависим от хранителните вещества фактор, секретиран от чревни ентероендокринни клетки, наскоро получи значително внимание като потенциална лекарствена цел и ендогенен регулатор на енергийния метаболизъм (15, 21, 50). Потенциално важно взаимодействие между GIP и грелин е предложено от първоначални експерименти с изолирани стомашни плъхове, които предполагат възможно пряко влияние на GIP върху секрецията на грелин (27). В допълнение, описателни проучвания за асоциация показват, че концентрациите на грелин след хранене са обратно свързани с концентрациите на GIP след хранене при здрави индивиди (6). Тези и други данни предполагат GIP като интригуващ кандидат за молекулярния посредник, контролиращ постпрандиалната секреция на грелин: 1) GIP се секретира дистално от стомаха от чревни K клетки в отговор на поглъщането на хранителни вещества и действа за увеличаване на секрецията на инсулин в панкреаса (15); 2) стимулирането на секрецията на инсулин чрез GIP се извършва само при наличие на повишени нива на глюкоза (15); и 3) GIP рецепторите са представени в стомашната лигавица (39, 45) и са регулирани надолу при централно затлъстяване (39).

В нашето преди това докладвано пилотно проучване при здрави неносебни индивиди (38) не успяхме да демонстрираме регулиране на секрецията на грелин чрез GIP, вероятно обяснено с краткотрайна инфузия на GIP и фармакологични концентрации на нивата на глюкоза и инсулин по време на хипергликемичната скоба. Освен това, този дизайн на проучването не е в състояние да дисектира потенциално независими ефекти на GIP от инсулина върху секрецията на грелин. По този начин взаимодействията GIP-грелин представляват недостатъчно проучена, но потенциално важна област на изследване (1, 8, 27, 38).

Като се има предвид, че GIP, подобно на инсулина, участва в регулирането на метаболизма на въглехидратите и мазнините (15, 21, 50), косвено синергичните и/или комбинаторни действия на GIP и/или инсулина чрез промени в плазмения метаболом могат да повлияят на секрецията на грелин. Нещо повече, противоречивите резултати от различни техники на прилагане на глюкоза и/или инсулин, водещи до влияния върху междинните метаболити и в крайна сметка тяхното въздействие върху секрецията на грелин (17, 18), може да отразяват подценената множественост на техните ефекти. Взаимодействията хормон-хормон често демонстрират сложни модели на комбинаторни или/и синергични ефекти в гъста мрежа от обмен на молекулярна информация (5). Поради това приложихме анализ на метаболомичните системи, за да търсим нови ендокринни и метаболитни сигнални модели, влияещи върху регулирането на грелин.

Целта на това проучване е да се изследва функционалната връзка между GIP и грелин, независимо или независимо от концентрацията на кръвната глюкоза и инсулина. За да се справим с този проблем, използвахме GIP инфузионен тест и експерименти с евгликемична и хипергликемична глюкоза, комбинирани с инфузия на GIP или плацебо по кръстосан начин при мъже с умерено наднормено тегло. Освен това, ние приложихме мрежов корелационен анализ на метаболитните профили, за да проучим генерираните данни за молекулярни връзки, отразяващи взаимодействията GIP-грелин.

Субекти

Това проучване е одобрено от Етичната комисия на Бранденбург, Германия [регистрационен номер. AS 2 (a)/2005]. Всички лица са дали писмено информирано съгласие преди проучването. Това проучване е предварително регистрирано на www.cliniccaltrials.gov (NCT00774488).

Изследвани са четиринадесет доброволци мъже с наднормено тегло (възраст 47,4 ± 8,4 години, ИТМ 32,5 ± 2,2 kg/m 2, съотношение между талията и ханша 1,0 ± 0,1, тегло на мазнините 31,6 ± 5,4 kg, постно тегло 67,5 ± 3,2 kg, кръвна захар на гладно 4,9 ± 0,4 mmol/l). Изключени са пациенти с повишаване на чернодробните ензими над два пъти над горните нормални граници или с повишени серумни концентрации на креатинин (> 1,3 mg/dl). Нито един от доброволците не е показал данни за метаболитно заболяване или непоносимост към глюкоза при натоварване с глюкоза през устата от 75 g (11) и всички съобщават за стабилно телесно тегло в продължение на поне 12 месеца. Никой от участниците не е участвал в някакъв вид подходяща програма за упражнения. Всички участници, с изключение на един предмет, не са пушачи. Субектите са инструктирани да поддържат нормалната си физическа активност и да консумират нормална диета, съдържаща 200 g въглехидрати в продължение на 3 дни преди и 14 дни по време на проучването.

Уча дизайн

метаболомичната

Фиг. 1.Дизайн на изследването. Четиринадесет лица с умерено затлъстяване бяха проучени на четири пъти и изложени всеки път на 1 от 6 различни състояния: инфузирани с глюкагоноподобен пептид-1 (GIP, 2,0 pmol · kg -1 - min -1) или плацебо, или на гладно, по време на евгликемични хиперинсулинемични скоби (EC; концентрация на глюкоза в кръвта 4,4 mmol/l) или по време на хипергликемични хиперинсулинемични скоби (HC; концентрация на глюкоза в кръвта 7,8 mmol/l).

Пептиди

Синтетичният GIP е закупен от PolyPeptide Laboratories (Wolfenbüttel, Германия) и обработен за интравенозна инфузия, както е описано (30). При всички субекти е използван GIP от същата партида (F-0818X2).

Експериментални процедури

Всички проучвания са направени сутрин на гладно през нощта (> 10 часа след последното хранене). Две вени на предмишницата бяха пробити с канюли и пазени с използване на 0,9% физиологичен разтвор (за вземане на проби от кръв и съответно за прилагане на глюкоза, инсулин и пептид). И двата дяла на ухото бяха хиперемирани с помощта на Finalgon (Nonivamid 4 mg/g, Nicoboxil 25 mg/g). За всички скоби са използвани човешки инсулин (Actrapid; Novo Nordisk, Bagsværd, Дания) и глюкоза (Serag Wiessner, Naila, Германия). В експериментите, плацебо (0,9% NaCl, Fresenius, Германия) или GIP при скорост на инфузия 2,0 pmol · kg -1 min min -1 се дава като продължителна интравенозна инфузия за 240 минути. Всички тестове бяха проведени в продължение на 240 минути. Във всички тестове се вземат проби от венозна кръв на -70, 0, 60, 120, 180, 210, 220, 230 и 240 минути спрямо началото на инфузиите.

В експериментите с евгликемична хиперинсулинемична скоба (16) непрекъсната интравенозна инфузия на инсулин, комбинирана с физиологичен разтвор или GIP инфузия, започва на 0 минути от теста. В стационарно състояние на скобата, капилярната кръвна глюкоза се коригира до 4.4 mmol/l за най-малко 80 минути. По време на скобата, плазмените концентрации на глюкоза се наблюдават на всеки 5 минути и се използват за регулиране на плазмената глюкоза чрез регулиране на променлива инфузия на глюкоза. Отклонение на единична капилярна концентрация на глюкоза над 10% по време на предполагаеми стационарни условия беше определено като нестационарно състояние.

Експериментите с хиперинсулинемична хипергликемична скоба, целящи стабилна концентрация на капилярна плазмена глюкоза от 7,8 mmol/l, бяха започнати чрез инжектиране на 20% глюкоза като болус [болусна глюкоза = телесно тегло (kg) × 0,3 g глюкоза] за 0 минути и се поддържаха чрез вливане на глюкоза (20% във вода), според случая, въз основа на определяне на глюкозата, извършвани на всеки 5 минути. Екзогенната хиперинсулинемия беше постигната чрез непрекъсната инфузия на 40 mU · m −2 · min −1 човешки инсулин в продължение на 240 минути, за да се получат сравними концентрации на циркулиращ инсулин, в скобите както с плацебо, така и с GIP инфузия. За потискане на ендогенната секреция на инсулин, 150 mg диазоксид (Proglycem, Schering, Германия) се дава два пъти (-60 min и 120 min) по време на експериментите. Диазоксидът е отварачка за канали KATP, която потиска секрецията на инсулин чрез хиперполяризиране на β-клетките (13). Соматостатинът, който обикновено се използва за потискане на ендогенното производство на инсулин, сам по себе си инхибира секрецията на грелин (18) и би повлиял на нашите експерименти.

Аналитични процедури

Всички проби от венозна кръв веднага се центрофугират и замразяват при -70 ° C, докато се анализират. Концентрациите на капилярна глюкоза в кръвта се определят с помощта на глюкозооксидазен метод на глюкозен анализатор на Dr. Müller (Freital, Германия). Серумният инсулин и С-пептидът се измерват, като се използва търговски ензимно-свързан имуносорбентен анализ (Insulin ELISA, C-Peptide ELISA, Mercodia, Uppsala, Швеция). Човешкият плазмен грелин е измерен с търговски радиоимуноанализ (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA), който използва 125 I-маркиран биоактивен грелин като проследяваща молекула и поликлонално антитяло, отгледано в зайци срещу октаноилиран човешки грелин с пълна дължина [вариращ коефициент в рамките на анализа (CV) 4%]. Не се съобщава за кръстосана реактивност с човешки секретин, човешки вазоактивен чревен пептид, човешки галанин, човешки GHRH, NPY или други съответни молекули (34). Концентрациите на общия GIP се определят в плазмени проби, съдържащи апротинин (Trasylol, Bayer-Германия, за инхибиране на протеази), като се използва човешки GIP (Total) ELISA Kit (Linco Research). Чувствителността е била 8,2 pg/ml, интра-тестовата CV е 3,0–8,8%, а интерактивната CV е 1,8–6,1%.

Изчисления и статистически и мрежови анализи

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на SPSS за Windows 16.0 (SPSS, Чикаго, Илинойс). Данните са представени като средни стойности ± SE. Изчислена е средна стойност на двете последователни изходни проби (-70 и 0 минути), за да се намалят индивидуалните вариации в базалните нива. Стационарните концентрации на хормони са изчислени като средни стойности от 210-, 220-, 230- и 240-минути. Поради изкривеното разпределение на изследваните хормонални параметри бяха използвани непараметрични тестове. Сравненията между групите бяха извършени с помощта на Mann-Whitney U-тест и в рамките на групи сравнение с подписания тест за ранг на Wilcoxon. Разликите се считат за статистически значими при P

Фиг. 2.Промени в общите серумни концентрации на грелин (средни стойности 210–240 минути) в% към базовото ниво на всеки експеримент: GIP инфузия (GIP-inf), NaCl инфузия (NaCl-inf), хиперинсулинемични евгликемични скоби с NaCl (EC + NaCl) и GIP инфузия (EC + GIP); хиперинсулинемични хипергликемични скоби с NaCl (HC + NaCl) и GIP инфузия (HC + GIP). Сиви ленти, експерименти с инфузия на NaCl; излюпени решетки, експерименти с GIP инфузия при скорост на инфузия (2,0 pmol · kg -1 -1 min -1). Данните са показани чрез графики "кутия и мустаци". Кутията се простира от 25-ти до 75-ти% ile, с линия в средната посока, показваща 50th% ile. Мустаците представляват диапазони, простиращи се от най-ниската до най-високата стойност. *P

Тестове за хиперинсулинемична евгликемична скоба.

В тези експерименти стационарните концентрации на глюкоза и серумните концентрации на инсулин не се различават между тестовете с GIP и NaCl инфузия (серумен инсулин: 398,4 ± 88,2 срещу 379,8 ± 75,0 pmol/l, съответно, P = 0,26). Плазмената концентрация на GIP по време на инфузията е 123,13 ± 12,48 pmol/ml и е значително по-висока от инфузията с физиологичен разтвор (5,07 ± 1,02 pmol/l, P

Таблица 1. Плазмени метаболити, корелирани с грелин по време на всеки тип експеримент

Коефициентите на корелация на Пиърсън са засенчени за 2 нива на значимост на коефициентите на корелация P

Фиг. 3.Участие на грелин в GIP-зависима хормонално-метаболитна мрежа, съчетаваща данни от 3 експеримента: GIP инфузионен тест, хиперинсулинемични евгликемични скоби с GIP и хиперинсулинемични хипергликемични скоби с GIP. Цветен код за йерархично разстояние от грелин: директните съединители бяха зелени, съединителите на следващите поръчки са жълти, след това червени. Координираните промени се показват с непрекъсната линия; противоречивите промени се показват с прекъсната линия.


Фиг. 4.Общ брой връзки на грелин с други хормони и метаболити в различните мрежи от експерименти. Броят на свързаностите е даден за 2 нива на значимост на коефициентите на корелация: P

Тук представяме нови данни, показващи, че GIP потиска циркулиращия грелин независимо от инсулиновите ефекти в хипергликемичната скоба. Това се подкрепя от наблюдаваното изразено участие на грелин в хормонално-метаболитната мрежа чрез координирани промени в пула от дълговерижни мастни киселини. При хиперинсулинемичната евгликемия ефектът на GIP върху циркулиращия грелин е малък, но все още статистически значим, което предполага, че потискането на секрецията на грелин изисква хипергликемични условия, подобни на инсулинотропното действие на GIP. За разлика от това, GIP няма ефект върху нивата на циркулиращ грелин при гладно.

Способността на GIP да потиска секрецията на грелин беше изненадваща, тъй като показва индиректен потискащ ефект на GIP върху апетита и поведението на приема на храна. Преди 13 години беше изказана хипотезата, че GIP може да участва в регулирането на апетита (25). GIP, но не и GLP-1, се увеличава бързо след интрадуоденална инфузия на глюкоза и се наблюдават намаления в степента на глад, както и в приема на енергия и повишена пълнота. Интересното е, че коинфузията на октреотид потиска секрецията на инкретини и води до обръщане на усещанията за глад (25). По-късни проучвания с подобен дизайн (9, 36) показват дозозависимо потискане на грелин при интрадуоденално приложение на глюкоза. Този ефект не е свързан с повишаване на концентрациите на инсулин или глюкоза. Въпреки това, проучвания, използващи директно интравенозно приложение на GIP, показват противоречиви резултати по отношение на регулирането на апетита (4, 10, 46).

Важно е да се отбележи, че откриването на метаболити в настоящото проучване е направено чрез полуколичествен метод и че резултатите от наблюдаваните промени в пуловете на мастните киселини се нуждаят от допълнителна репликация чрез количествен метод.

В настоящото проучване най-голямото намаляване на грелина се наблюдава при GIP инфузия по време на хипергликемична хиперинсулинемична скоба. Следователно нивата на инсулин бяха малко по-високи в присъствието на GIP, въпреки че това не беше статистически значимо. Тъй като обаче значително повишените нива на инсулин предизвикват само малко намаление на грелина при евгликемични условия, е малко вероятно разликата в нивата на инсулин да се дължи на разликата в нивата на грелин. В предишното ни пилотно проучване при здрави неносеби (38) не успяхме да демонстрираме регулиране на секрецията на грелин чрез GIP. Въпреки това могат да бъдат включени методологически разлики между публикуваните преди това проучвания и настоящото изследване. В първото ни проучване (38) бяха постигнати по-високи концентрации на глюкоза и инсулин по време на хипергликемична скоба и GIP инфузия беше дадена за 1 час, последвана от инфузия на аргинин. Като се има предвид типичният модел на секреция на грелин с намаляване при 60 и 120 минути след хранене (44), протоколът за инфузия в предишното ни проучване е вероятно твърде кратък, за да се наблюдават ефектите на GIP върху грелин.

В заключение, резултатите от настоящото проучване показват, че GIP потиска общите нива на грелин в циркулация независимо от инсулина. Това предположение беше подкрепено от интегративни анализи на хормонално-метаболитната мрежа, които демонстрираха координирани промени в дълговерижния пул на мастните киселини. Взаимното взаимодействие между стомашно-чревните хормони GIP и грелин може да повлияе на сигналите за насищане от червата към мозъка и да доведе до потискане на чувството за глад и апетита.

Изследването е подкрепено с безвъзмездна финансова помощ от Германското федерално министерство на образованието и научните изследвания (грант № 0313042C за NN Rudovich и Ö. Gögebakan) и с грант от Германската научна фондация (DFG Grant № 164/021002 за NN Rudovich, Ö. Gögebakan и AFH Pfeiffer). Част от данните бяха представени на Европейския конгрес по ендокринология 2010 в Прага.

Не се декларират конфликти на интереси, финансови или други, от автора (авторите).