Характеризиране на EV, CINV и MDNV, получени от човешки ендометриални MSC. (а) Естествените EV са оцветени с три специфични за ендозомите тетраспанини; те показаха фенотипа CD9 +, CD81 + и CD63 +. (б) Количеството на EV, CINV и MDNV с различни размери (диаметър, Ø), както е оценено чрез електронна микроскопия. (c - g) Предавателна електронна микроскопия на (c) естествени EV и (d) CINVs, изолирани чрез диференциално центрофугиране 100 × g, 600 × g и 15 000 × g, и MDNVs, приготвени от (e) Fr/Th, (f) 15 минути UB + Fr/Th, или (g) 3 часа UB + Fr/Th. Скала = 100 nm.

Получено от MSC EV зареждане с FAM-ON, извършвано от Fr/Th, проникване със сапонин или обработка с ултразвук. Използва се анализ на поточната цитометрия. (а) Контрол, неспецифично свързване на FAM-ON с латексни зърна при липса на EV. (b, c) Анализ на поточна цитометрия на EV, натоварен при стандартни условия (15 µg EVs и 1 nmol FAM-ON в 200 µL TBS), извършен чрез Fr/Th, лечение със сапонин или обработка с ултразвук. (г) Влияние на концентрацията на FAM-ON върху ефективността на EV натоварване от Fr/Th. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение; пунктираната линия показва теоретичната крива. Всички експерименти бяха проведени в TBS. Извършен е статистически анализ с U-теста на Mann-Whitney; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Зареждане на CINV и MDNV с FAM-ON. (а) Сравнение на зареждане на EV, CINV или MDNVs с FAM-ON от Fr/Th. (б) Генериране на MDNVs от UB в разтвор, който съдържа FAM-ON. (c) Генериране на MDNVs от UB, последвано от зареждане с FAM-ON от Fr/Th. Комплексите EV-FAM-ON, CINV-FAM-ON и MDNV-FAM-ON бяха имобилизирани върху 4 µm гранули алдехид/сулфат латекс и анализирани чрез поточна цитометрия. За да се сравнят правилно различните техники за генериране на MDNV, Fr/Th е избран като положителна контрола и наблюдаваното ниво на Fr/Th Rfu е зададено на 1 (показано като червената, пунктирана линия). Всички експерименти бяха проведени в TBS, който съдържаше 15 ug нановезикули и 50 microM FAM-ON. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение. Извършен е статистически анализ с теста на Ман-Уитни; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Доставка FAM-ON в клетки HEK293, медиирана от EVs, CINVs и MDNVs. Петнадесет и 50 µg EV, CINV или MDNV бяха заредени с FAM-ON (50 µM) от Fr/Th. Комплексите бяха използвани за FAM-ON доставка в HEK293 в DMEM + 10% FBS, Opti-MEM или Opti-MEM + 10% FBS за 4 или 8 часа. Извършена е липофекция, съответстваща на препоръките на производителя (1 µL липофектамин 2000, 0,25 nmol FAM-ON на 10 5 клетки, краен обем = 250 µL). Данните са представени като средно ± стандартно отклонение. FAM-ON контрол и доставка на FAM-ON с помощта на Lipofectamine 2000 са посочени съответно като жълта и розова кутия (± SD област). Експериментите са посочени в следните цветове: EV – FAM-ON - сиво, MDNV – FAM-ON - синьо, CINV – FAM-ON - зелено, 15 µg - светли цветове, 50 µg - тъмни цветове. Статистическият анализ беше извършен с теста Mann-Whitney U и беше направен в сравнение с контрола FAM-ON; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Анализ на товароносимостта на CINV. Количеството FAM-ON, които бяха заредени до 15 µg CINVs чрез Fr/Th, измерено чрез относително ниво на интензивност на флуоресценция. Нановезикулите, които се съхраняват при -80 ° C не по-дълго от 3 месеца, са показани в син цвят, а тези, съхранявани в продължение на 14 месеца, са показани в зелено. Кривата на калибриране е показана с пунктирана линия. Контролът FAM-ON Fr/Th – измиване – утаяване се показва с червената плътна линия.

Резюме

микромашини

Характеризиране на EV, CINV и MDNV, получени от MSC на човешки ендометриум. (а) Естествените EV са оцветени с три специфични за ендозомите тетраспанини; те показаха фенотипа CD9 +, CD81 + и CD63 +. (б) Количеството на EV, CINV и MDNV с различни размери (диаметър, Ø), както е оценено чрез електронна микроскопия. (c - g) Предавателна електронна микроскопия на (c) естествени EV и (d) CINVs, изолирани чрез диференциално центрофугиране 100 × g, 600 × g и 15 000 × g, и MDNVs, приготвени от (e) Fr/Th, (f) 15 минути UB + Fr/Th, или (g) 3 часа UB + Fr/Th. Скала = 100 nm.

Получено от MSC EV зареждане с FAM-ON, извършвано от Fr/Th, проникване със сапонин или обработка с ултразвук. Използва се анализ на поточната цитометрия. (а) Контрол, неспецифично свързване на FAM-ON с латексни зърна при липса на EV. (b, c) Анализ на поточна цитометрия на EV, натоварен при стандартни условия (15 µg EVs и 1 nmol FAM-ON в 200 µL TBS), извършен чрез Fr/Th, лечение със сапонин или обработка с ултразвук. (г) Влияние на концентрацията на FAM-ON върху ефективността на EV натоварване от Fr/Th. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение; пунктираната линия показва теоретичната крива. Всички експерименти бяха проведени в TBS. Извършен е статистически анализ с U-теста на Mann-Whitney; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Зареждане на CINV и MDNV с FAM-ON. (а) Сравнение на зареждане на EV, CINV или MDNVs с FAM-ON от Fr/Th. (б) Генериране на MDNVs от UB в разтвор, който съдържа FAM-ON. (c) Генериране на MDNVs от UB, последвано от зареждане с FAM-ON от Fr/Th. Комплексите EV-FAM-ON, CINV-FAM-ON и MDNV-FAM-ON бяха имобилизирани върху 4 µm гранули алдехид/сулфат латекс и анализирани чрез поточна цитометрия. За да се сравнят правилно различните техники за генериране на MDNV, Fr/Th е избран като положителен контрол и наблюдаваното ниво на Fr/Th Rfu е зададено на 1 (показано като червената, пунктирана линия). Всички експерименти бяха проведени в TBS, който съдържаше 15 µg нановезикули и 50 µM FAM-ON. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение. Извършен е статистически анализ с теста на Ман-Уитни; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Доставка FAM-ON в клетки HEK293, медиирана от EVs, CINVs и MDNVs. Петнадесет и 50 µg EV, CINV или MDNV бяха заредени с FAM-ON (50 µM) от Fr/Th. Комплексите бяха използвани за FAM-ON доставка в HEK293 в DMEM + 10% FBS, Opti-MEM или Opti-MEM + 10% FBS за 4 или 8 часа. Извършена е липофекция, съответстваща на препоръките на производителя (1 µL липофектамин 2000, 0,25 nmol FAM-ON на 10 5 клетки, краен обем = 250 µL). Данните са представени като средно ± стандартно отклонение. FAM-ON контрол и доставка на FAM-ON с помощта на Lipofectamine 2000 са посочени съответно като жълта и розова кутия (± SD област). Експериментите са посочени в следните цветове: EV – FAM-ON - сиво, MDNV – FAM-ON - синьо, CINV – FAM-ON - зелено, 15 µg - светли цветове, 50 µg - тъмни цветове. Статистическият анализ беше извършен с теста Mann-Whitney U и беше направен в сравнение с контрола FAM-ON; * p ≤ 0,05, ** p p ≤ 0,01.

Анализ на товароносимостта на CINV. Количеството FAM-ON, които бяха заредени до 15 µg CINVs чрез Fr/Th, измерено чрез относително ниво на интензивност на флуоресценция. Нановезикулите, които се съхраняват при -80 ° C не по-дълго от 3 месеца, са показани в син цвят, а тези, съхранявани в продължение на 14 месеца, са показани в зелено. Кривата на калибриране е показана с пунктирана линия. Контролът FAM-ON Fr/Th – измиване – утаяване се показва с червената, плътна линия.