Молекулярна и клетъчна патология и

основа

Детско здраве, Медицинско училище Ninewells, Университетът, Дънди, Шотландия

Молекулярна и клетъчна патология и

Детско здраве, Медицинско училище Ninewells, Университетът, Дънди, Шотландия

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Синдромът на Gilbert (GS) е лека, неконюгирана хипербилирубинемия, възникваща при липса на чернодробно заболяване или явна хемолиза и се характеризира с епизоди на лека интермитентна жълтеница; 1 общ билирубин в серума (STB)> 18 μmol/L, повишаващ се до 25-50 μmol/L след 24-часова 1680 kJ диета. 2

Чернодробният микрозомален билирубин уридин дифосфат-глюкуронозилтрансфераза (B-UGT) катализира конюгацията на билирубин с глюкуронова киселина, за да образува по-разтворимия във вода билирубин диглюкуронид, който се екскретира чрез АТФ-зависимия транспортер, MRP2, през жлъчния канал. 3 Билирубин уридин дифосфат-глюкуронозилтрансфераза е ограничаващ скоростта ензим за елиминиране на билирубин 4 и неконюгираната хипербилирубинемия може да бъде причинена от дефекти в гена B-UGT (UGT ‐ 1A1).

Тук преглеждаме данните, които предполагат, че мутациите в UGT ‐ 1A1 гена са отговорни за синдрома на Gilbert и много случаи на продължителна неонатална жълтеница.

АНАЛИЗ НА UGT ‐ 1A1 ГЕН

Анализ на последователността на полимеразна верижна реакция на кодиращите региони на UGT ‐ 1A1 Генът (B-UGT) (Фиг. 1) разкрива поне 30 различни мутации, водещи до тежка хипербилирубинемия, описана от синдромите на Crigler – Najjar (CN) I и II. 4 Признаването на намаляването на хипербилирубинемията в отговор на фенобарбитал в CN ‐ II показва, че чернодробният билирубин UGT може да се индуцира от лекарства и да се свърже с намаляване на серумния билирубин. 4 В действителност, потенциални сайтове за регулиране на лекарства се наблюдават в 5 ′ региона непосредствено пред UGT ‐ 1 ген. Очевидно мутацията в интроните или регулаторната област също може да доведе до намаляване на активността на билирубин UGT и хипербилирубинемия. 5

Структура на интрон/екзон на уридин дифосфат-глюкуронозилтрансферазата (UGT ‐ 1A1) ген. Диаграмата показва UGT ‐ 1A1 компонента на генния комплекс UGT ‐ 1 и промоторния регион на TATA кутията.

UGT ‐ 1A1 ПРОМОТЕР И СИНДРОМ НА ДЖИЛБЕРТ

Генетичното разстояние между специфични екзони 1 и 2 на UGT ‐ 1 генният комплекс е приблизително 13 kb 6 и може да бъде описан като UGT ‐ 1A1 промоутър. 500 bp веднага 5 'от UGT ‐ 1A1 началният сайт на транскрипцията съдържа няколко потенциални регулаторни елемента, включително „Барби кутия“, активатор протеин-1 (AP1) и консенсусна последователност на C-E свързващ протеин (C-EBP) за свързване на тези транскрипционни фактори. 7 Всъщност, нокаутирането на C-EBPα от мишката води до жълтеникав фенотип, което предполага, че този транскрипционен фактор може да бъде ключов компонент в регулирането на експресията на UGT на билирубин. 8 Тази 500 bp последователност съдържа също необичаен промоторен регион (TA) 6TAA. Bosma и колеги, в предварителна работа, 9 предполагат, че вмъкването на ТА 6 в този регион за образуване (TA) 7TAA може да бъде свързано със синдрома на Gilbert. Впоследствие екипът на Bosma 10 и групата на Dundee 11 активно проучиха това предложение. Генетичната вариация, TA вмъкване ((TA) 7TAA алел) в TATA кутията на промотора UGT-1A1, беше тясно свързана с хипербилирубинемия при пациенти на Gilbert. Чернодробната активност на UDP-глюкуронозилтрансферазата е намалена до приблизително 30% от нормалните нива при пациенти със синдром на Gilbert. 10

Проучванията на жителите на Източна Шотландия 11 и популациите на канадските инуити показват хомозиготния генотип на алела (TA) 7TAA при 12-17% от тестваните. 12 Фигура 2 показва вариацията на мутантния алел в партида проби. Популяризиращи региони на UGT ‐ 1A1 генът в ДНК на пациента се усилва чрез полимеразна верижна реакция и произведените ДНК фрагменти се анализират с помощта на Applied Biosystems 310 Analyzer (Applied Biosystems, Warrington, UK). Семейни проучвания разкриват наследяването на алела (ТА) 7TAA и тясната връзка със серумните нива на общия билирубин (фиг. 3).

Полимеразна верижна реакция (PCR) –ДНК фрагментен анализ на промотора на уридин дифосфат-глюкуронозилтрансферазата (UGT-1A1). Фигурата показва анализ на пет ДНК проби и показва генетичната вариация в кутията TATA от размера на идентифицираните фрагменти. Алел (TA) 6TAA е представен като фрагмент от 94 bp и алел (TA) 7TAA от фрагмент от 96 kb. Хетерозиготите произвеждат и двата фрагмента.

Наследяване на алела (TA) 7TAA в семейно проучване, демонстриращо сегрегация на (TA) 7TAA генотип с повишена серумна концентрация на билирубин в семейство. Мъжете и жените са представени съответно от квадрати и кръгове. Изпълнените и наполовина запълнени кръгове/квадратчета показват генотипите 7/7 и 6/7. Цифрите под всеки член на родословието показват серумната концентрация на билирубин. Възрастта на членовете на семейството е в скоби.

СЪОТВЕТСТВИЕ НА ФЕНОТИП И ГЕНОТИП В ИЗСЛЕДВАНИЯТА НА НАСЕЛЕНИЕТО

Корелацията на серумния билирубин с (TA) 7TAA алела не е непременно очевидна от изследването на случайна популация поради фактори на околната среда. 11 Нивата на серумен билирубин са пряко свързани с нивото на експресия на UGT активност на чернодробния билирубин. 13 Това проучване също директно демонстрира, че етанолът може да индуцира активността на UGT на чернодробния билирубин, 13 посочвайки как факторите на околната среда могат да повлияят на нивата на серумния билирубин. Има много фактори, които могат да повлияят на измерения фенотип, като наркотици, алкохол, тютюнопушене, възраст и пол. 7 Когато доброволческите популации се въздържат от наркотици, употребата на алкохол и тютюнопушенето и серумният билирубин се измерва след бързо нощуване, се измерват по-реалистични фенотипни серумни билирубинови стойности. 11 Данните от този тип проучвания разкриват, че фенотипът и генотипът могат да бъдат по-добре корелирани, отколкото със случайна непроучена популация (Таблица 1).

Серумният билирубин също е в значителна корелация с възрастта при мъжки 7/7 генотипове (хомозиготни за алела (TA) 7TAA) от група доброволци и осигурява друг фактор, който влияе върху оценката на генотипа спрямо фенотипната асоциация (G Monaghan, J Smith и B Burchell, непубликувана работа, 1998). По-рано недиагностицирани пациенти с ГС са идентифицирани по генотип и 10–13% от населението проявява 7/7 генотип. Въздържането от наркотици, тютюнопушене и алкохол в клинична среда често ще разкрие неочаквана хипербилирубинемия, свързана със синдрома на Gilbert. 12 Няколко съвсем скорошни проучвания изследват световните популации за TA динуклеотидни полиморфизми в UGT ‐ 1A1 промоутър. Тези резултати са обобщени в таблица 2. Тези данни показват, че алелът 7/7, свързан с GS, присъства при до 23% от африканците, но е много рядък при японците и азиатците (14 Неотдавнашно италианско проучване установи, че 90% от лица, класифицирани като GS, проявяват генотип 7/7

ДРУГИ ГЕНОТИПИ ЗА НАСЪРЧАВАНЕ НА ТАТА, СВЪРЗАНИ С ХИПЕРБИЛИРУБИНЕМИЯ

Идентифицирани са три нови вариации на генотипа, свързани с промотора на кутията TATA и хипербилирубинемия. Хетерозиготните генотипове са 5/6, 5/7 и 7/8 (напр. (TA) 8TAA). Не са идентифицирани други кодиращи мутации в UGT ‐ 1A1 ген (G. Monaghan и др., непубликуване. данни).

Алелна вариация 5/6 има леко повишен STB (22 срещу 15,6 μmol/L за 6/7 мъже). Генотип 5/7 показва продължителна неонатална жълтеница (STB 127 μmol/L на постнаталния ден 57), а генотип 7/8 има STB без гладуване от 54–68 μmol/L, което е малко по-тежко от повечето пациенти с GS 2 ( G Монаган и др., непубликуване. данни, 1999).

По този начин сега има четири UGT ‐ 1A1 TATA генотипове, свързани с GS. Вмъкването или изтриването на TA повторения в TATA промотора (по отношение на най-често срещания алел, шест повторения) е свързано с хипербилирубинемия. Субектът 7/8, описан в настоящия доклад, илюстрира припокриващи се концентрации на STB между хетерозиготи на GS и Crigler – Najjar (с дефекти на кодиращата последователност).

Неотдавнашен доклад предполага, че тези по-редки генотипове са свързани само с африканското население, което показва расова изменчивост. 14 Въпреки това петте индивида, идентифицирани в нашата лаборатория с алели 5 и 7, са от шотландски (европейски) кавказки произход, а не от африкански. Следователно, предложението за расова изменчивост, направено от Бютлер и др. 15 не беше потвърдено от нашата работа (G Monaghan и др., непубликуване. данни, 1999).

ХЕТЕРОЗИГОЗНИ МУТАЦИИ В UGT ‐ 1A1 ГЕННИ ЕКЗОНИ КАТО ГЕНЕТИЧНА ПРИЧИНА НА СИНДРОМА НА ГИЛБЕРТ

Честотата на мутациите на TATA кутия е само 3% при азиатци 14 и японци. 16 Следователно има значителни разлики между японски/азиатски популации и европейски и африкански популации в мутациите на TATA. 14 Неотдавнашната работа показа, че леко засегнатите членове на семейства, в които се среща CN тип II, са хетерозиготни за мутации в UDP-глюкуронозилтрансферазата UGT ‐ 1A1 (G71R и Y486D), могат да бъдат клинично класифицирани като пациенти със синдром на Gilbert. 17, 18 Японско и азиатско проучване на населението разкрива висока честота на алела G71R, особено при жълтеникави японски новородени 19 (Таблица 3).

Алелът G71R не е открит при анализирана европейска популация. 19 Хетерозиготната и хомозиготна мутация G71R причинява приблизително 40 и 70% намаляване на експресията на билирубин UGT. Очевидно и двата генотипа могат да доведат до клинично определен фенотип в различните популации. Съставните генетични дефекти, които водят до по-тежка хипербилирубинемия, могат да бъдат наречени Crigler-Najjar тип II в някои японци, тъй като всеки полиморфен генотип е доста често срещан сред японската популация. 21.

СИНДРОМ НА ГИЛБЕРТ И УДЪЛЖЕНА НЕОНАТАЛНА ЖЪЛТИЦА

Неонаталната жълтеница се появява при приблизително 50% от новородените през първите 5 дни от живота (предимно от неконюгиран билирубин) и се нарича физиологична жълтеница. 22 Новородените имат забавено съзряване на експресията на билирубин UDP-глюкуронозилтрансфераза (UGT-1A1) с нормална активност, постигната до 3-месечна възраст. 23 При нормални, доносени новородени човешки STB се повишава до приблизително 100 μmol/L през първите 72 h (нормална STB за възрастни ≤ 17 μmol/L) и намалява в рамките на 7–10 дни. Плазмените билирубини са по-високи при кърмените бебета, достигайки 256–410 μmol/L през първите 10–19 дни от живота, като жълтеница в кърмата (BMJ) се среща при 0,5–34% от новородените, кърмени. 24-26 Диагностичните изследвания за патологична жълтеница обикновено се извършват при доносени новородени със STB> 200 μmol/L. 27 Мейзели и др. не са успели да открият патологични причини при 56% от доносените бебета със STB> 200 μmol/L. 28 Високата честота на GS (обикновено се счита за състояние за възрастни) ни накара да проучим дали необяснимата жълтеница при доносени новородени е ранен израз на GS. Банкрофт и др. предполага, че GS ускорява развитието на неонатална жълтеница през първите 2 дни от живота. 29

Изследвахме 85 новородени с необяснима жълтеница и установихме значителна връзка между развитието на много продължителна жълтеница и генотипа 7/7 при кърмачета. Открихме, че GS може да обясни жълтеница при 31% от групата с много продължителна жълтеница. 30 Изключихме също хетерозиготност за кодиращи мутации на последователности (статус на носител на CN) като причина за продължителна хипербилирубинемия в 31% от случаите, въпреки че тези усложнения могат да допринесат за останалите 69% от случаите. Смята се, че факторите в кърмата инхибират чернодробната UDP-глюкуронозилтрансферазна активност при новороденото или стимулират реабсорбцията на билирубин от червата, като по този начин допринасят за хипербилирубинемия. 24 Следователно по-ниските нива на експресия на UGT-1A1 при 7/7 бебета (в допълнение към факторите на кърмата) могат да направят кърмените бебета по-уязвими от бебетата, хранени с бутилка, към продължителна хипербилирубинемия.

Повишената податливост на жълтеница от кърма при американските индианци 31 и аляскинските ескимоси 32 може да се дължи на по-високата честота на GS в тези популации. Наскоро показахме, че канадската ескимоска популация има 17–19% 7/7 генотип в сравнение с 12% в шотландската популация. 10, 11 американски индианци 31 и аляскински ескимоси 32 може да имат подобна честота на мутация 7/7, въпреки че това не е изследвано. Трябва обаче да се отбележи, че катаболизмът на хема е увеличен при бебета навахо спрямо контролите, които не са навахо. 33 Следователно, идентифицирането на GS (7/7 генотип) при новородени може да бъде свързано със симптоми, проявяващи се като много продължителна неконюгирана хипербилирубинемия при доносени кърмени новородени. Желателно е да се идентифицират по-ясно случаи с истинска патологична причина и да се избягват ненужни тестове. Предлагаме генетичен скрининг за GS (7/7) като прост, полезен допълнителен тест при изследването на много продължителна неонатална жълтеница при популации в Северна Америка, Африка и Европа. Скринингов тест за мутация на Gly 71 Arg може също да бъде полезен при японски и азиатски популации.

СИНДРОМ И ЖЪЛТИЦА НА ДЖИЛБЕРТ ПРИ ДРУГИ ГЕНЕТИЧНИ БОЛЕСТИ

Само генотипът 7/7 може да не утаява новородената жълтеница без други фактори на околната среда, като тези, изразени в кърмата. Въпреки това, комбинацията от този често срещан генотип с други генетични дефекти може да доведе до утаяване на жълтеница, тъй като метаболитната система на хема е подложена на допълнителен стрес. Каплан и др. са показали, че съединено генетично взаимодействие със синдрома на Gilbert и дефицит на глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа ще доведе до неонатална хипербилирубинемия. 34 По подобен начин хипербилирубинемията при наследствена сфероцитоза 35 и хетерозиготна β-таласемия 36 е свързана със съвместния генотип 7/7 на Gilbert’s синдром.

ИЗМЕНЕНИЕ НА ГЛУКУРОНИДИРАНЕ НА ЛЕКАРСТВА, СВЪРЗАНО С ФЕНОТИПА НА GILBERT’S

Това заболяване може да причини вариации в лекарствената глюкуронизация и възможни странични ефекти на лекарството поради разпространението на фамилното разстройство сред населението. Няма очевидни индикации за нарушено окисление, ацетилиране или сулфатиране на лекарството. 37 Наблюдава се намален клирънс на няколко лекарства, като толбутамид, аминопирин и парацетамол, 38 въпреки че намаленият клирънс очевидно не е свързан с намалена скорост на глюкурониране, измерена в проби от урина през нощта. 37

Де Морай и др. съобщават, че образуването на парацетамол глюкуронид, измерено при шест пациенти с GS чрез изчистване от плазмата в рамките на 2 часа, е с 31% по-ниско от нормалните контроли. 39 Времето за вземане на проби може да е от решаващо значение за определяне на тези значителни разлики и нивата в урината през нощта могат да бъдат по-добро измерване 37, тъй като UGT-1A1 не се счита за ключов ензим в глюкуронирането на парацетамол. Всички тези проучвания са проведени без ползата от генотипирането за болестта на Gilbert.

Сега е признато, че има много ксенобиотични субстрати на UGT-1A1, основната форма на метаболизиране на билирубина, различна от самия билирубин, с примери, включващи октил галат, емодин и бупренорфин, 41, 42, които имат потенциал да предизвикат жълтеница чрез конкурентно инхибиране на UGT ‐ 1A1, особено при пациенти с GS, чиято чернодробна активност е намалена до 35% от нормалните нива. 10

По-важното е, че полиморфните вариации при пациенти с GS са свързани с намалена глюкуронизация на противораковото лекарство иринотекан (CPT-11). Васерман и др. наблюдавана токсичност с това лекарство при двама пациенти с GS. 43 Проучване на 40 пациенти показва, че няма разлика в честотата и тежестта на токсичността въз основа на раса и пол. 44 Интерпациентната вариабилност предполага фармакогенетични вариации. 44 Инхибиторът на топоизомераза 1 индуцира диария със забавено начало при пациенти с колоректален рак. 45 Билирубин UGT-1A1 е демонстрирал, че глюкуронира метаболита на CPT-11 7-етил-10-хидрокси камптотецин (SN-38). 46 Метаболитните съотношения (SN-38/SN-38 глюкуронид) при пациенти с 7/7 генотип са нехарактерно по-високи от тези при пациенти с други генотипове (6/6 и 6/7). Билиарният индекс е 6980 спрямо 2180 ± 1110 (диапазон 840–3730) при пациент със 7/7 генотип, съответно 6/6 генотип. 47

По този начин синдромът на Gilbert може също да бъде описан като фармакогенетична вариация, засягаща глюкуронирането и токсичността на терапевтичните лекарства.

Резюме

Синдромът на Гилбърт е може би най-често срещаният синдром, известен при хората. Последните молекулярно-генетични проучвания установиха, че клиничният фенотип може да бъде описан чрез динуклеотиден полиморфизъм в промотора на кутията TATA на гена UGT-1A1, най-често (TA) 7TAA, засягащ до 36% от африканците, но само 3% от азиатците . Втора често срещана хетерозиготна мутация в кодиращия екзон 1 на гена UGT ‐ 1A1 (G71R) също може да причини фенотипа на Gilbert при японци и азиатци.

Болестта на Gilbert е фактор, допринасящ за продължителната неонатална жълтеница при кърмачета и може да утаи жълтеница, когато е съвместна с други нарушения на метаболизма на хема, а генетичните вариации, описани като синдром на Gilbert, могат да доведат до фармакологични вариации в глюкуронизацията на лекарството и неочаквана токсичност от терапевтичните агенти.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на шотландския Министерство на домовете и здравеопазването и благотворителния тръст за средствата, подпомагащи тази работа.