•  

Резюме

Въведение

Изследователски дизайн и методи

Модел на мишка и метаболитен анализ

Сърбеж -/- мишки на фон C57/BL10 са описани по-рано (10-12). Сърбеж -/- мишки и диви видове (WT) отпадъци се поддържат на 12-часови светли и тъмни цикли при контролирани условия на околната среда, със свободен достъп до вода и храна. Изследванията се извършват само при мъжки мишки. Проучванията върху животни са одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните в Университета в Тор Вергата. За модела на затлъстяването, предизвикан от диетата, мишките на възраст от 6 до 8 седмици са били хранени с високомаслена диета (HFD) (60% от калориите от мазнини; Research Diets, New Brunswick, NJ) или нормална диета (ND) (стандартна чау 10% калории от мазнини; GLP Mucedola Srl, Settimo Milanese, Италия) в продължение на 12 седмици след отбиването, както е посочено. Процедурите за метаболитно тестване са описани по-рано (14,15). Общи нива на холестерол, HDL, триглицериди, аспартат аминотрансфераза (AST) и нива на аланин аминотрансфераза (ALT) бяха измервани с помощта на Keylab (BPC Biosed s.r.l., Рим, Италия). Тъканите бяха събрани на гладно или в преработено състояние, както е посочено. При експериментите на гладно животните са гладували 16 часа. При експериментите за повторно хранене храната се въвежда отново след 16 часа на гладно и животните се убиват 6 часа след храненето, за да се изолират тъканите. Индиректната калориметрия беше извършена, както е описано по-рано (16).

диабет

Изолиране на миши перитонеални макрофаги

Перитонеалните макрофаги са изолирани от WT и сърбеж// - мишки и се характеризират, както е описано по-рано (17). Накратко, макрофаги са събрани от мишки, които предварително са инжектирани с 1 ml 3% тиогликолатен бульон (Sigma-Aldrich) в продължение на 3 дни, последвано от промиване на перитонеалната кухина с 10 ml студен PBS. Перитонеалните клетки се промиват със студен PBS, центрофугират се при 1000 rpm в продължение на 10 минути и се преброяват. За пречистване на макрофаги, клетките се инкубират при 37 ° С в модифицирана среда на Dulbecco Eagle’s/F12-10 среда. РНК се извлича от прикрепени клетки и се използва за анализ на генната експресия. За анализ на активиран с флуоресценция клетъчен сортер (FACS), перитонеалните клетки бяха центрофугирани, ресуспендирани в балансиран солев разтвор на Ханкс и допълнително обработени, както е описано по-долу.

Изолиране на адипоцити и стромална съдова фракция

Адипоцитни и стромални съдови фракции (SVF) са изолирани от WT и сърбеж -/- бяла мастна тъкан (WAT) след 12 седмици HFD, както е описано по-рано (16). РНК се изолира от адипоцити и SVF и се анализира чрез PCR в реално време. Профилът на експресията на адипонектин иРНК се използва за тестване на чистотата на изолираните фракции.

Анализ на генната експресия

Обща РНК беше изолирана от мастна тъкан, черен дроб, перитонеални макрофаги, макрофаги, получени от костен мозък, RAW 264,7 клетки и 3T3 F44 клетки, използвайки реагенти Trizol (Invitrogen Corp., Eugene, OR). Общата РНК (2 ug) се транскрибира обратно в cDNA, като се използва cDNA архив с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster City, CA). Извършена е количествена PCR в реално време и резултатите са анализирани, както е описано по-рано (16).

Western Blots

Уестърн петна се извършват, както е описано по-рано (18). Използвани са следните антитела: фосфо-Insr Tyr 972, общо Insr, фосфо-Ser 473 Akt, общо Akt (клетъчна сигнална технология), човешки ITCH/AIP4 (Abcam) и миши ITCH (BD Pharmigen).

Хистологичен анализ

Epididymal WAT, междускапуларна кафява мастна тъкан (BAT), черен дроб и чревни тъкани са получени от мишки, хранени с HFD в продължение на 12 седмици; пробите бяха фиксирани в 10% параформалдехид и вградени в парафин. След това десет микрометра последователни секции бяха монтирани на предметни стъкла и оцветени с хематоксилин-еозин (Н-Е). Оцветяването с маслено червено О се извършва върху чернодробни секции от криоконсервирани биопсии. Фотомикрографиите са заснети с микроскоп Eclipse TE 2000-S (Nikon) при увеличения × 10 и × 20. Размерът на мастните клетки се измерва под същия микроскоп при × 10 увеличение с скала от 5 μm на единица градуиране. Диаметърът от 50 клетки в две произволни микроскопични полета беше определен с помощта на Lucia G, версия 4.61 (Build 64), софтуер за всяка мишка. Тежестта на неалкохолната мастна чернодробна болест се основава на количеството и видовете мазнини (макровезикуларна и микровезикуларна), степента на възпаление, наличието на клетъчна дегенерация (ацидофилни тела, балониране и хиалин на Mallory) или некроза и степен на фиброза.

Анализ на поточната цитометрия

Анализът на FACS на черния дроб е извършен, както е описано по-рано (19). Накратко, черният дроб се усвоява с колагеназа 4 (Sigma-Aldrich). След това пробите бяха подложени на градиент на плътност FICOLL (LSM-1077; Sigma-Aldrich) и оцветени с CD45-APC (BD Pharmigen), CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) и F4/80-PE (Miltenyi Biotec). Клетките, събрани от перитонеалната кухина, се оцветяват за повърхностни антигени CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) и F4/80-PE (Miltenyi Biotec). Пробите бяха анализирани с помощта на FACScalibur (BD bioscience) с BD Cellquest Pro и анализирани с Flow JO (TreeStar, Ashland OR). Макрофагите бяха определени като CD45 + CD11b + F4/80 + .

Анализ на холестерола и триглицеридите

Холестеролът и триглицеридите бяха извлечени от чернодробните тъкани и анализирани с помощта на комплект за анализ на общия холестерол и комплект за количествено определяне на триглицериди (Cell Biolabs) в съответствие с инструкциите на производителя.

Изследвания на генна експресия на човешка мастна тъкан

Проучени са петдесет проби от висцерална мастна тъкан от група кавказки субекти с ИТМ между 20 и 58 kg/m 2, наети в Ендокринологичната служба на болничния университет Dr. Dr. Josep Trueta (Жирона, Испания). Всички субекти прегледаха, че телесното им тегло е стабилно поне 3 месеца. Те не са имали системно заболяване, различно от затлъстяване, и всички са били без никакви инфекции през предходния месец преди проучването. Чернодробните заболявания и дисфункцията на щитовидната жлеза са специално изключени чрез биохимична работа. Всички субекти дадоха писмено информирано съгласие, след като им бяха обяснени целта, естеството и потенциалните рискове за изследването. Комитетът по болнична етика одобри протокола. Проби от мастна тъкан са получени по време на планови хирургични процедури (холецистектомия, хирургия на коремна херния и стомашна байпас), измити, фрагментирани и незабавно замразени в течен азот, преди да се съхраняват при -80 ° C и се използват за анализ.

Имунохистохимия

Пет-микрометров участък от фиксирана във формалин парафинова мастна тъкан беше депарафинизиран и рехидратиран преди демаскирането на антигена. Секциите бяха инкубирани с анти-ITCH/AIP4 (Abcam), анти-CD68 (Santa Cruz Biotechnology) и анти-CD3 (Thermo Scientific, Fremont, CA). Секциите бяха оцветени с хематоксилин и изследвани под микроскоп Nikon Eclipse 90i. Като отрицателна контрола, процедурата се извършва при липса на първично антитяло.

Статистически анализи

Резултатите от експерименталните изследвания са средни стойности ± SD. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на еднопосочен ANOVA или несдвоен тест на Student t, както е посочено. Анализът на линейна корелация е извършен с помощта на теста на Спирман. Стойности на P -/- Мишки

На 6-седмична възраст, сърбежите -/- мишки, хранени със стандартна чау, показват по-ниско тегло и по-ниски нива на кръвната глюкоза на гладно в сравнение със същите възрастни WT коти (фиг. 1А и В). Тези разлики обикновено изчезват с остаряването при мишки, хранени със стандартна чау. Сърбеж -/- мишки показват Th2 поляризация на лимфоцитите поради високата експресия на IL-4 и IL-13 (12). За да определим дали увеличаването на Th2 лимфоцитите води до увеличаване на поляризацията на M2 макрофаги, ние оценихме генната експресия на M1 и M2 маркери на перитонеални макрофаги от WT и Itch -/- мишки, хранени със стандартна чау след стимулиране на тиогликолатен бульон. Перитонеалните ексудати от WT и сърбеж -/- мишки разкриха сходни нива на изолирани CD11b + F4/80 + клетки (допълнителна фигура 1А). Въпреки това, сърбежът// - макрофагите показват значително увеличение на експресията на М2 маркери Mgl2, Arg1 и Ym1. Експресията на М1 маркери остава сходна (Фиг. 1С). In vitro понижаване на експресията на сърбеж с малка интерферираща РНК в макрофаги, получени от костен мозък и в RAW 267,4 клетки, клетъчна линия на миши макрофаги, доведе до намаляване на IL-1β и EMR1 и увеличаване на експресията на IL-10 след лечение с комбинация от LPS и IFN-γ, докато след стимулация с IL-4 установихме само намаляване на EMR1 (допълнителни фиг. 1В и С).

Метаболитна характеристика на сърбеж -/- мишки. Шестседмични мишки WT и Itch -/- хранеха ND. Тегло (A) и концентрация на глюкоза в кръвта (B) (n = 8 на група; ** P -/- Мишки

Представителен Western blot анализ на ITCH протеин в мастната тъкан (AT), изолирани адипоцити (адипоцитна фракция [AF]) и SVF (A). Представителен Western blot анализ на ITCH протеин в AT, изолирани адипоцити (AF) и SVF (B). Изображенията са представителни за части от мастна тъкан, събрани от пет субекта. CLS, короноподобна структура; ма, макрофаг. Стрелките показват ITCH- и CD3-положителни клетки. Корелация между експресията на сърбеж и CD-206 mRNA (C) (r = -0,36, P = 0,01) и съотношението CD206 към CD68 (D) (r = -0,42, P = 0,003) в човешката мастна тъкан (n = 50 ). Експресията на иРНК се определя чрез PCR в реално време и се нормализира до циклофилин А. R.U., относителни единици; ДДС, висцерална мастна тъкан.

Дискусия

Анализът на напречното сечение на мастните биопсии ясно свързва нивата на сърбеж с възпалението на мастната тъкан, особено със съотношението M2 към M1, изразено с помощта на два добре приети маркера за тези състояния на поляризация на макрофагите.

Установихме, че когато HFD е прекъснат, сърбежните// - мишки са склонни да поддържат теглото си. Тези данни предполагат, че ефектът от сърбежния дефицит върху затлъстяването се медиира от възпаление, предизвикано от диетата, и очевидно при липса на възпалителен стимул (HFD) дефицитът на сърбеж не засяга метаболитния фенотип на мишките. Превеждайки нашите резултати в терапевтична перспектива, намираме за изкушаващо да спекулираме с отговора Th2 като лечение на затлъстяването и неговите метаболитни продължения при определени условия (27). Подходящият диетичен режим, който да се прилага по време на противовъзпалително метаболитно лечение, също е от значение, тъй като е известно, че някои форми на липиди влияят положително или отрицателно на възпалителния отговор (28,29). Ефектът от инхибирането на ITCH върху мастната тъкан може да бъде добавъчен към други пътища, за които е доказано, че са от значение за овладяване на метаболитното възпаление в скелетната мускулатура, като TNF-α-конвертиращия ензимен път, който е сдържан положително от пиоглитазон, a PPAR-γ агонист с противовъзпалителни ефекти при пациенти с диабет тип 2 (30,31).

Тъй като нокдаунът на сърбежа не пречи на адипогенезата и само леко пречи на поляризацията на M1 in vitro и сърбежите -/- мишки разкриват нормален прием на храна и липса на чревно възпаление, изкушаващо е да се предположи, че защитният ефект, наблюдаван in vivo, зависи от инфилтрацията на макрофаги, която възниква в мастната тъкан по време на прогресията на затлъстяването. Въпреки това, нашите данни показват, че ITCH действа като фактор за ограничаване на пристрастията Th2 in vivo и неговите последици върху затлъстяването и метаболитното възпаление, особено когато се налага диета, богата на липиди. Две възможни ITCH цели, които трябва да бъдат изследвани в по-механистични модели, са p73 и промиелоцитна левкемия (PML). Известно е, че ITCH влияе отрицателно на p73 (32,33), който регулира нивата на ПМЛ протеин (34). Дефицитът на ПМЛ е свързан с индуцирано от диетата затлъстяване (35,36), а р73-нулевите макрофаги са пристрастени към M1 поляризация in vivo (37); ние предварително забелязахме, че ПМЛ се увеличава както при WAT, така и при НДНТ при сърбеж -/- мишки (допълнителна фигура 5), което подкрепя ролята на ПМЛ при метаболитни нарушения, въпреки че са необходими допълнителни проучвания, за да се разбере дали пътят ITCH/p73/PML действа на ниво моноцити/макрофаги или адипоцити.

Нашите резултати потвърждават доказателствата, че медиираното от макрофагите възпаление в мастната тъкан играе важна роля в развитието на затлъстяването и неговите метаболитни усложнения. Пристрастието Th2/M2 при мишките Itch -/- причинява хронична M2 поляризация на макрофаги, инфилтриращи мастната тъкан, предпазваща от наддаване на тегло и последващи метаболитни нарушения по време на обезогенен стимул. Взети заедно, нашите данни посочват ролята на медиирани от ITCH пътища в регулирането на сложните взаимодействия между вродения имунитет и метаболизма.

Информация за статия

Финансиране. Това проучване беше финансирано отчасти от Fondazione Roma 2008, ESFD/Lilly 2012, AIRC 2012 Project IG 13163, FP7-Health-241913 FLORINASH, FP-7 EURHYTHDIA и PRIN 2009FATXW3_002 до M.Fe .; SAF-2012-33014 от Ministerio de Economía y Competitividad, Испания, до B.P .; и Съвет за медицински изследвания, Обединено кралство, отпуска ACC12, MIUR/PRIN (20078P7T3K_001)/FIRB (RBIP06LCA9_0023, RBIP06LCA9_0C), AIRC (2011-IG11955) и AIRC 5xmille (MCO # 9979), Telethon grant GGPO91 dege IDI ID de3333 -IRCCS (RF08 c.15, RF07 c.57) към GM.

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.