Неутрализацията на протеини 1 с групова кутия с висока мобилност намалява развитието на диета

bg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

От BakerIDI Heart and Diabetes Institute, Мелбърн, Виктория, Австралия (P.K., A.A., T.S.K., C.K., I.A., K.P., A.B.); Катедра по фармакология и патология, Медицински факултет на университета Окаяма, университет Окаяма, Окаяма, Япония (S.M., H.K.T., K.L., M.N.).

Преглеждате най-новата версия на тази статия. Предишни версии:

Резюме

Обективен-

Груповият протеин 1 с висока подвижност (HMGB1) е ДНК-свързващ протеин и цитокин, силно експресиран в атеросклеротични лезии, но неговата патофизиологична роля при атеросклерозата е неизвестна. Изследвахме неговата роля за развитието на атеросклероза при ApoE -/- мишки.

Методи и резултати—

Аполипопротеиновите Е-дефицитни (ApoE -/-) мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, са получили моноклонално анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло и ефектите върху размера на лезиите, натрупването на имунни клетки и провъзпалителните медиатори са оценени с помощта на Oil Red O, имунохистохимия, и верижна реакция на полимераза в реално време. Както при човешките атеросклеротични лезии, лезиите при ApoE -/- мишки експресират HMGB1. Лечение с неутрализиращо антитяло атенюира атеросклерозата с 55%. Натрупването на макрофаги е намалено с 43%, а експресията на молекула-1 на съдова клетъчна молекула и моноцитен хемоаттрактант протеин-1 е намалена съответно с 48% и 72%. CD11c + дендритните клетки са намалени с 65%, а зрялата (CD83 +) популация е намалена с 60%. Лечението също намалява CD4 + клетките с близо 50%. тРНК в лезии, кодиращи фактор на туморна некроза-α и интерлевкин-1β, обикновено намаляват. Механично, HMGB1 стимулира миграцията на макрофаги in vitro и in vivo; in vivo, той значително увеличи натрупването на F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + макрофаги и също така увеличи броя на F4/80 + CD11b + макрофагите.

Заключение—

HMGB1 упражнява проатерогенни ефекти, увеличаващи развитието на лезиите, като стимулира миграцията на макрофаги, модулира провоинфламаторните медиатори и насърчава натрупването на имунни и гладкомускулни клетки.

Структурно HMGB1 има тристранна организация на домейн. Той съдържа 2 подобни ДНК-свързващи домена, HMG Box A и Box B, и уникален С-краен домен, състоящ се от кисела опашка от 30 аминокиселини, всички свързани с къси аминокиселинни последователности. 17 Провъзпалителната активност на HMGB1 е локализирана в Box B и антителата, издигнати срещу Box B, предотвратяват действията на HMGB1 17,18; рецепторът за свързан домен на крайни продукти за гликиране (RAGE) е локализиран в С-терминалния компонент на кутия В и сегмента, свързващ се с киселинната опашка. 19 За разлика от това, кутия А намалява индуцираното от HMGB1 освобождаване на възпалителни цитокини. 20,21 Смята се, че киселата опашка е неструктурирана и взаимодейства със специфични основни остатъци в двете кутии, като вероятно регулира тяхната конформация. 22.

Провъзпалителните ефекти на HMGB1 се дължат на взаимодействието му с редица типове рецептори, което изглежда зависи от фактори, свързани с HMGB1. RAGE, тол-подобен рецептор (TLR) 2 и TLR4 изглежда медиират провъзпалителни ефекти в HMGB1-стимулирани макрофаги. 23,24 HMGB1 в ДНК имунни комплекси и нуклеозомни комплекси изглежда оказва провъзпалителни ефекти чрез TLR9 и TLR2, съответно. 12,25 Съвсем наскоро беше показано, че HMGB1 взаимодейства с CD24 и Siglec-10, за да смекчи имунните отговори, предизвикани от увреждане на тъканите 26; предлага се баланс между тях и вредните ефекти на HMGB1, за да се определи общата величина на неговите вредни ефекти. 26

HMGB1 е замесен в редица имунозадвижвани заболявания, включително системен лупус еритематозус, автоимунен диабет и артрит. 9,27,28 При артрит предизвиква възпаление чрез активиране на макрофаги и индуциране на IL-1. 28 Тъй като HMGB1 е свръхекспресиран при атеросклеротични лезии 3–5 и активира имунни процеси, които могат да увеличат атеросклерозата, 4,11,13–15 изследвахме неговата роля в развитието на атеросклероза при аполипопротеинови Е-дефицитни мишки (ApoE -/- мишки). Използвахме анти-HMGB1 неутрализиращо моноклонално антитяло, което взаимодейства конкретно със С-крайната последователност на HMGB1 в рамките на киселата опашка, за да определим неговата роля в атеросклерозата. Това антитяло реагира с HMGB1, а не с HMGB2 и е показано, че инхибира HMGB1 отговорите в макрофагите и подобрява мозъчния инфаркт, предизвикан от преходна исхемия. 29

Материали и методи

Шестседмични мишки ApoE -/- са хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 8 седмици и им се прилага или анти-HMGB1 моноклонално антитяло, или IgG2a контрола (400 μg IV два пъти седмично). В края на проучването мишките бяха убити с предозиране на пентобарбитон и бяха събрани кръв, аортен синус и дъга, далак и лимфни възли за хистологични и молекулярни изследвания. Пролиферацията на моноцити in vivo се оценява след прилагане на бромодезоксиуридин (1 mg IP) в продължение на 3 дни преди мишките да бъдат убити. Хемотаксичните ефекти на HMGB1 върху моноцитите се оценяват при мишки 5 часа след прилагане на HMGB1 (20 μg) в перитонеалната кухина.

Подробен раздел за допълнителни методи е достъпен онлайн на .

Резултати

Експресия на HMGB1 при атеросклеротични лезии

HMGB1 е силно експресиран при атеросклеротични лезии при хора, най-вече от макрофаги, в които близо 50% от клетките съдържат HMGB1 в цитоплазмата си. 3 Следователно ние изследвахме дали атеросклеротичните лезии при ApoE -/- мишки също експресират HMGB1. HMGB1 се експресира в аортния синус на ApoE -/- мишки и се ограничава до клетки в атеросклеротичната интима (Фигура 1). HMGB1 изглежда е свързан с клетки, често в цитоплазмата и също дифузно разпределен в лезиите; последният най-вероятно отразява секретирания HMGB1 (Фигура 1).

Фигура 1. Имунохистохимична идентификация на експресията на HMGB1 при атеросклеротични лезии на аортния синус при мишки ApoE -/-. Вляво, HMGB1 (червено оцветяване) е локализирано в интимни клетки (горна вложка) и също дифузно разпределено в лезиите (долна вложка). Клетките в медията не изразяват HMGB1. Вдясно, регион, подобен на този, показан в А, инкубиран с неспецифичен заешки IgG вместо основния заешки HMGB1 IgG. Разрезът беше оцветен с хематоксилин. Скалата представлява 100 μm.

Ефект на неутрализирането на HMGB1 върху размера на атеросклеротичните лезии

На 14-седмична възраст (8 седмици лечение с антитела) нивата на общия плазмен холестерол, липопротеиновия холестерол с ниска плътност, холестерола на липопротеините с висока плътност и триглицеридите не се различават при мишки, лекувани с контролни или анти-HMGB1 неутрализиращи антитела (Допълнителна таблица I) . Въпреки това, анализът на оцветените в масло червено O-секции на аортния синус разкри значителни разлики в отлагането на липиди и размера на атеросклеротичните плаки (Фигура 2). Морфометричният анализ показа, че анти-HMGB1 неутрализиращото антитяло намалява размера на лезията в сравнение с лечението с контролно антитяло, 89 253 ± 13 098 μm 2 спрямо 183 903 ± 11 784 μm (P 2 при мишки, лекувани с анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло в сравнение със 141 364 ± 12 608 μm 2 с контролно антитяло (Фигура 2). За да определим дали ефектите на HMGB1 антитялото се дължат на неутрализиращ циркулиращ HMGB1, ние измерихме плазмените нива на HMGB1 в контролни и анти-HMGB1 антитяло третирани мишки, използвайки специфичен HMGB1 ELISA. Плазмените нива на HMGB1 са неоткриваеми (30 предполага, че ефектите на неутрализиращото антитяло са локални на мястото на развиващите се лезии.

Фигура 2. Микрофотографии на атеросклеротични лезии на аортния синус от мишки ApoE -/- хранени с високомаслена диета и третирани с контролно антитяло (Ab; вляво) и анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло (вдясно). Най-горните секции показват разрези, оцветени с маслено червено О и средни области на оцветяване (стълбовидна диаграма) при 2-те групи мишки. Долни срезове, имунохистохимично оцветяване с използване на анти-CD68 (макрофаги) антитяло и средни области на оцветяване (стълбовидни графики) при 2-те групи мишки. Червеното означава контролно антитяло; синьо, анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло. *P

Ефект на неутрализиращия HMGB1 върху състава на атеросклеротичните лезии

Анализът на състава на атеросклеротичните лезии също разкрива разлики между 2-те групи по отношение на клетъчния състав. Тъй като HMGB1 може да стимулира миграцията на дендритни клетки, 14,15 изследвахме дали неутрализиращата активност на HMGB1 отслабва тяхното натрупване в развиващите се лезии. Имунохистохимичните проучвания и количественият анализ показват значително намаляване на натрупването на дендритни клетки, като оцветяването на CD11c е средно 8 ± 1% от площта на лезията в аортния синус на мишки, третирани с анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло в сравнение с 24 ± 3% с контролно антитяло (P 15 изследвахме дали е засегната експресията на CD83, маркер за съзряване на дендритни клетки. Експресията на CD83 в лезиите представлява само малка част от популацията на дендритните клетки, което показва, че популацията на дендритните клетки е до голяма степен незряла (Фигура 3). Лечението с анти-HMGB1 антитялото намалява CD83 клетъчната популация с близо 60% (P 31 Следователно, ние изследвахме дали CD4 + Т-клетъчното натрупване е повлияно при мишки, лекувани с анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло. Лечението с неутрализиращо анти-HMGB1 антитяло намалява натрупването на CD4 + Т-клетки в лезии с ≈50% (P 0,05; Фигура 4) 32; Тим-1, маркер на Th2 лимфоцити, не може да бъде открит (Фигура 4). 33

Фигура 3. Имунохистохимия на атеросклеротични лезии на аортния синус от контролно антитяло (Ab; вляво) и анти-HMGB1 антитяло (вдясно) - третирани ApoE -/- мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Напречните сечения бяха оцветени с анти-CD11c антитяло за откриване на дендритни клетки (отгоре) и анти-CD83, маркер на зрели дендритни клетки (отдолу). Стълбовидните графики представляват степента на имунооцветяване в двете групи. Червеното означава контролно антитяло; синьо, анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло. *P

Фигура 4. Разпределение на CD4 + Т клетки в атеросклеротични лезии на аортния синус и тяхната поляризация след третиране на мишки ApoE -/- с контролно антитяло или анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло. Отгоре, напречните сечения бяха оцветени с анти-CD4 антитела за откриване на CD4 + лимфоцити в лезии на контролни (вляво) и третирани с анти-HMGB1 антитела (вдясно) мишки. Долу вляво, стълбовидна диаграма, показваща CD4 + лимфоцитна плътност в лезиите. Отдолу вдясно, стълбовидна диаграма, показваща относителното изобилие от иРНК, кодиращи Tim3 и Tim1 в лезии. Червеното означава контрол; синьо, анти-HMGB1 лечение. *P

HMGB1 неутрализиращи и възпалителни медиатори в лезии

HMGB1 може да увеличи експресията на редица провоспалителни медиатори, включително MCP-1, молекула на съдова клетъчна адхезия-1 (VCAM-1) и различни цитокини, включително IL-1β, IL-6 и туморна некроза-α (TNF-α ). 12,36,37 Изследвахме дали лечението с анти-HMGB1 неутрализиращи антитела може да повлияе на експресията на такива провъзпалителни медиатори при развиващи се лезии. Лечението с анти-HMGB1 неутрализиращи антитела намалява експресията на VCAM-1 в лезии с 50% и експресията на MCP-1 с близо 70% (и двете P 13 За да потвърдим хемоаттрактантните действия на HMGB1 върху миши макрофаги, първо оценихме способността му да стимулира мишка RAW264.7 миграция на макрофаги, използвайки 24-ямкови камери за хемотаксис. HMGB1 стимулира тяхната миграция, повече от удвоявайки броя на мигриралите макрофаги (P

Фигура 5. HMGB1-стимулиран макрофагичен хемотаксис in vitro и интраперитонеално набиране на макрофаги in vivo. A, Миграция на RAW264.7 макрофаги на мишки in vitro в отговор на носител или HMGB1 (4 μg/mL). B, Брой F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + макрофаги, наети в перитонеалната (пер.) Кухина 5 часа след IP инжектиране на превозно средство или HMGB1 (20 μg/mL). C, цитометричен анализ на потока от перитонеална промивка, демонстриращ популации F4/80 и Gr-1 5 часа след инжектиране на носител или HMGB1. Областите в кутия показват F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + население. D, Брой F4/80 + CD11b + макрофаги, наети в перитонеалната кухина 5 часа след IP инжектиране на превозно средство или HMGB1. *P

Дискусия

По-рано съобщавахме, че HMGB1 се експресира от макрофаги в човешки аортни мастни ивици и фибро-мастни лезии. 3 При напреднали атеросклеротични плаки, HMGB1 се експресира и от съдови клетки на гладката мускулатура. 5 Също така, серумните нива на HMGB1 са свързани с коронарна артериална болест. 38,39 В това проучване ние демонстрирахме, че атеросклеротичните лезии в аортния синус на мишки ApoE -/- също експресират HMGB1, което допринася за развитието на лезиите. Неутрализирането на HMGB1 с помощта на моноклонално антитяло, насочено към аминокиселини в рамките на киселата опашка, 29 отслабва развитието на атеросклероза. Нашето проучване предполага, че HMGB1 в лезиите, а не в циркулиращия HMGB1, допринася за атеросклерозата, стимулира миграцията на макрофагите и увеличава натрупването на други типове имунни клетки, както и провъзпалителни медиатори.

HMGB1 упражнява множество ефекти върху моноцити/макрофаги in vitro. Той стимулира миграцията на макрофагите, прилепването и разпространението на 13 моноцити, взаимодействията между моноцитите и матрицата, 40 и миграцията на дендритни клетки. 14 Нашите наблюдения разширяват тези открития и показват, че HMGB1 също е хемоаттрактивен in vivo за макрофагите; HMGB1 стимулира миграцията на F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + макрофаги, подтип, за който е известно, че се натрупва в атеросклеротични лезии. 41 Не изглежда да влияе върху пролиферацията на монобласт/промоноцити, броя на моноцитите в кръвта или изтичането на дендритни клетки от лезии.

В допълнение към въздействието върху имунните клетки, HMGB1 може да повлияе на съдовите гладкомускулни клетки, стимулирайки тяхната миграция 11 и пролиферация. 4 Лечението с анти-HMGB1 неутрализиращи антитела намалява натрупването на гладкомускулни клетки и броя на пролифериращите клетки в рамките на развиващите се лезии. Счита се, че интимата е „почвата“, в която се развива атеросклероза, 44 и отслабването на нейното развитие/растеж чрез неутрализиране на активността на HMGB1 и намаляване на популацията на гладката мускулатура на интимата може да допринесе за намаляването на размера на лезията. Въпреки че HMGB1 също така е показал, че стимулира пролиферацията на ендотелни клетки и ангиогенезата, не изглежда, че ендотелните клетки са засегнати от лечение с анти-HMGB1 неутрализиращо антитяло.

Въпреки че нашите проучвания показват, че HMGB1 допринася за развитието на лезии, като стимулира миграцията на макрофагите и активира дендритните клетки, рецепторите, чрез които тези ефекти се медиират, остават да бъдат идентифицирани. Интересно е да се отбележи, че ефектите, които наблюдаваме върху макрофагите, дендритните клетки и Т-клетките, както и съдовите клетки на гладката мускулатура, се дължат до голяма степен на взаимодействията с RAGE. 11,13,15,16 Инхибирането на RAGE отслабва развитието на лезиите и е свързано с намаляване на натрупването на макрофаги и гладки мускулни клетки, както и с намаляване на експресията на VCAM-1, 45 ефекти, които наблюдаваме след неутрализиране на HMGB1. Не можем обаче да изключим възможността HMGB1 да взаимодейства и с други рецептори по време на развитие на атеросклероза, включително TLR2, TLR4 или системата CD24/Siglec-10. Нашите открития предоставят окуражаваща основа за разработването на нов терапевтичен подход за атеросклероза, вероятно използвайки по-нови формати на рекомбинантни антитела.

В заключение, нашите данни разширяват по-ранните констатации за експресията на HMGB1 в човешки атеросклеротични лезии и показват, че локално, 1 експресиран HMGB допринася за развитието на лезии чрез стимулиране на миграцията на макрофаги и модулиране на възпалителни медиатори като MCP-1 и VCAM-1. HMGB1 също косвено допринася за натрупване на дендритни клетки и CD4 + Т клетки. Констатациите определят нова потенциална терапевтична цел за атеросклероза.

Популярен

Те четат сега