Отделение за биохимична невробиология, Лайбниц-Институт за молекулярна фармакология, Берлин, Германия

нова

Отделение за биохимична невробиология, Лайбниц-Институт за молекулярна фармакология, Берлин, Германия

Партньорство Max-Rubner-Laboratorium, Deutsches Institut für Ernährungsforschung, Потсдам-Рехбрюке, Германия

Център за биомедицински изследвания, Медицинско училище в Хъл Йорк, Университет в Хъл, Хъл, Обединеното кралство, Катедра за експериментална кардиология, Клъстер за върхови постижения на кардио-белодробната система, Justus-Liebig-Universität Giessen, Giessen, Германия

Отделение по кардиология, Charité-Universitätsmedizin, Берлин, Германия

Принадлежност Mivenion GmbH, Берлин, Германия

Афилиационен център за биомедицински изследвания, Медицинско училище в Хъл Йорк, Университет в Хъл, Хъл, Обединеното кралство, Отдел за експериментална кардиология, Клъстер за върхови постижения на кардио-белодробната система, Justus-Liebig-Universität Giessen, Giessen, Германия

  • Матиас Бекер,
  • Вълк-Еберхард Сиемс,
  • Райнхарт Клуге,
  • Флориан Гембард,
  • Хайнц-Петер Шултайс,
  • Майкъл Ширнер,
  • Томас Уолтър

Фигури

Резюме

Заден план

Според Световната здравна организация (СЗО) има пандемия от затлъстяване с около 300 милиона души със затлъстяване. Обикновено човешкото затлъстяване има полигенетична причинно-следствена връзка. Неутралната ендопептидаза (NEP), известна също като неприлизин, се счита за един от ключовите ензими в метаболизма на много активни пептидни хормони.

Методология/Основни констатации

Случайно наблюдение при мишки с дефицит на NEP е късно настъпило прекомерно покачване на телесно тегло изключително от повсеместно натрупване на мастна тъкан. В съответствие с полигенетичното човешко затлъстяване, мишките се характеризират с дерегулация на липидния метаболизъм, по-високи нива на глюкоза в кръвта, с нарушен глюкозен толеранс. Ключовата роля на NEP за определяне на телесната маса беше потвърдена от употребата на NEP инхибитор кандоксатрил при мишки от див тип, който увеличи телесното тегло поради увеличения прием на храна. Това е периферно, а не централно действие на NEP върху превключвателя за контрол на апетита, тъй като кандоксатрил не може да премине кръвно-мозъчната бариера. Освен това демонстрирахме, че инхибирането на NEP при мишки с кахексия забавя бързата загуба на телесно тегло. По този начин липсата на NEP активност, генетично или фармакологично, води до увеличаване на телесните мазнини.

Заключения/Значение

В настоящото проучване ние определихме NEP като ключов играч в развитието на затлъстяването. Мишките с дефицит на NEP започват да затлъстяват при нормалнокалорична диета на възраст 6-7 месеца и по този начин са идеален модел за типичното затлъстяване с късна поява при хората. Следователно, описаният модел на затлъстяване е идеален инструмент за изследване на развитието, молекулярните механизми, диагностиката и терапията на пандемичното затлъстяване.

Цитат: Becker M, Siems W-E, Kluge R, Gembardt F, Schultheiss H-P, Schirner M, et al. (2010) Нова функция за стар ензим: Мишките с дефицит от NEP развиват затлъстяване със късно начало. PLoS ONE 5 (9): e12793. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012793

Редактор: Алесандро Бартоломучи, Университет на Минесота, Съединени американски щати

Получено: 26 март 2010 г .; Прието: 18 август 2010 г .; Публикувано: 16 септември 2010 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездните средства на Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SI-483/8/1-2 и -3, както и WA1441/18/1-2 и -3). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Заплатата на MS се изплаща от Mivenion GmbH (Берлин, Германия). Това не променя придържането на авторите към всички политики PLoS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Човешкото затлъстяване е много сериозно здравословно разстройство, което има полигенетично предразположение и е придружено от драматични последователни заболявания (напр. Хипертония, повишен риск от инфаркт на миокарда, диабет и ставна подагра). През последните десетилетия наднорменото тегло [ИТМ 25–30] и затлъстяването [ИТМ над 30] се превърнаха в епидемия в индустриалните страни [1], [2]. Според статистиката на Обединеното кралство през 2006 г. 38% от възрастните са класифицирани като наднормено тегло, а 24% са затлъстели. Дори 30% от децата на възраст от 2 до 15 години са класифицирани като наднормено тегло или затлъстяване. Повече от 5% от бюджетите за обществено здраве в индустриализираните страни се изразходват за лечение на затлъстяване [3]. Въпреки това, медицинското лечение на затлъстяването досега е разочароващо с най-голямо въздействие от бариатричната хирургия. Следователно има критична необходимост от нови и иновативни стратегии за справяне с проблема, а молекулярното насочване е във фокуса на интензивните биомедицински изследвания. Човешкото затлъстяване има полигенетична причинно-следствена връзка [4]. В този контекст генетично модифицираните животни, особено няколко нокаутиращи мишки, представляват най-голям интерес.

Резултати и дискусия

Използвайки мишки с дефицит на NEP и техните контроли от див тип за патофизиологичен и биохимичен анализ [15] - [17], ние наблюдаваме, че мишките с генетична делеция на NEP се характеризират с увеличаване на телесното тегло, което става очевидно само при възрастни животни от двете полове (Фигура 1а). Първото изследване на този ефект идентифицира значително натрупване на мастна тъкан, която не е ограничена до коремните мазнини (Фигура 1б и в). Подробно регистриране на телесното тегло в продължение на една година идентифицира значителни разлики в теглото както за жените, така и за мъжете, започвайки на възраст от около. 7 месеца (Фигура 1г и д) поради продължаване на наддаването на телесно тегло, докато дивите видове достигат плато с тегло. Екстраполиран към човека, този период от време в живота на мишката съответства на възраст от около. 35 до 40 години, когато много хора стават с наднормено тегло. За да проучим дали увеличаването на телесното тегло е свързано с повишен прием на храна, ние измерихме примерно при жените приема на храна в два различни времеви момента. Когато разликите между двата генотипа се появяват за първи път (около 7-ия месец) и при възрастни животни (> 11 месеца), мишките с дефицит на NEP са яли значително повече от контролите им от див тип, съответстващи на възрастта (Фигура 1е).

(а) Сравнение на NEP-нокаутираща (NEP -/-) мишка с възрастово съвпадащо животно от див тип (NEP +/+). (б) Стеатоза на гръдния кош и сърцето при NEP-нокаутираща мишка. (° С) Натрупване на мазнини в корема при животно с дефицит на NEP. Зависимо от възрастта развитие на телесното тегло в (д) жени и (д) мъже. Данните са представени като средни стойности ± SEM. Там, където не е показано, лентите за грешки са в рамките на размерите на символите. Средно за група 22 мишки. Генотипни ефекти *** P 11-месечни женски NEP нокаутиращи мишки (NEP -/-) мишки в сравнение с възрастово съвпадащи животни от див тип (NEP +/+), * P Фигура 2. Състав на тялото и развитие на теглото в зависимост от диетата при мишки с дефицит на NEP.

NMR наблюдавано влияние на храненето върху зависимия от възрастта телесен състав при мишки, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини, разделена на (а) мускулни маси, (б) свободна телесна течност, (° С) мастни маси и (д) мастни маси на телесно тегло. Ефекти от (д) ниско съдържание на мазнини и (е) диета с високо съдържание на мазнини върху развитието на телесната маса. Данните са представени като средни стойности ± SEM за най-малко 10 животни на група. Двупосочен ANOVA ** P Фигура 3. Биохимични параметри при затлъстели NEP-дефицитни мишки при диета с ниско съдържание на мазнини.

(а) Серумни триглицериди при едногодишни животни с дефицит на NEP (-/-) и техните контролни групи от див тип (+/+). T-тест на студент *** P 2 0,92 [корелация на Пиърсън]). (д) Сравнение на основните стойности на глюкозата (преди тест за толерантност към глюкозата) в плазмата на NEP-нокаутиращи мишки с диви животни. T-тест на студент ** P Фигура 4. Ефекти на кандоксатрил (Pfizer, UK 79 300) върху развитието на телесната маса.

(а) Развитие на телесно тегло при мъжки мишки C57BL/6, започващи на възраст от 6 месеца, хранени със стандартна диета, допълнена с плацебо (плътна линия и квадратчета) или на NEP инхибитор кандоксатрил [консумация 200 mg/kg/ден] (прекъсната линия и триъгълници). Ден на лечение 0 е първият ден от лечението. Ефект от лечението *** P 30% между ден 12 и ден 23). Лечението с кандоксатрил, започващо на ден 9 след инокулация на тумора, доведе до значително по-слабо изразена загуба на телесно тегло в сравнение с контролно лекуваните мишки (Фигура 4д). Растежът на първичния тумор и теглото на черния дроб, далака и бъбреците на 23-ия ден след туморната имплантация не бяха повлияни от инхибирането на NEP.

Съществува критична необходимост от нови стратегии за лечение на затлъстяването, особено тъй като настоящото орално медицинско лечение е оказало слабо въздействие. Молекулярното насочване може да бъде един такъв подход. Идентифицирахме NEP да играе решаваща роля в приема на храна и в натрупването на мазнини. Тъй като развитието на затлъстяване при мишки с дефицит на NEP започва на 6-7 месеца, това е идеален модел за типично затлъстяване с късна поява при хората. За разлика от големия брой единични гени, описани като решаващи при нокаутиращите животни за развитие на затлъстял фенотип, NEP отговаря на критериите за класическа цел при затлъстяване с полигенетична причинно-следствена връзка. Тази металопептидаза хидролизира голям брой пептидни хормони и е широко разпространена в тялото.

За разлика от други модели на затлъстяване, нашите животни развиват фенотип със затлъстяване при нормокалорични условия. Интересното е, че при диета с високо съдържание на мазнини значителната разлика между двата генотипа намалява, тъй като мишките от див тип също стават затлъстели. Това прави животните с дефицит на NEP още по-подходящ модел на затлъстяване, тъй като отразява класическа ситуация, при която хората на средна възраст, консумиращи храна с нормално (дори здравословно) качество, стават с наднормено тегло, докато диетата им остава непроменена. В допълнение, животните с дефицит на NEP развиват аномалии на липидите и глюкозата, подобни на диабет тип 2, тъй като се развива затлъстяването [26].

Силен аргумент, подкрепящ NEP да бъде центриран в контрола на приема на храна, са данните от експеримент за обръщане. Ако намаляването на активността на NEP води до стимулиране на приема на храна, нейното фармакологично инхибиране трябва да предотврати значително намаляване на телесното тегло в модел на патологична загуба на телесно тегло. Можем да демонстрираме при мишки, носещи карцином на панкреаса PSN-1, че специфичното инхибиране на NEP значително намалява загубата на телесно тегло, докато експериментът не бъде спрян. Въпреки че психологическото въздействие при заболявания като анорексия нервоза може да бъде доминиращо, следващите експерименти трябва да оценят дали инхибирането на NEP или сигнализирането на NEP-насочени орексигени може да намали загубата на телесно тегло при заболявания с патологично намаляване на телесното тегло.

Тъй като фармакологичното увеличение на NEP може да бъде трудно, идентифицирането на орексигенни пептиди (и техните рецептори), повлияни от активността на NEP, може да бъде обещаващ целенасочен подход за намаляване на телесното тегло за лечение на затлъстяване.

Материали и методи

Животни

Използвахме мъжки и женски NEP-нокаутиращи мишки, които първоначално бяха генерирани от Lu et al. [33] и се поддържа в размножителните запаси на T.W. в Charité, Campus Benjamin Franklin (CBF), Берлин, Германия. Експериментални животни са били отглеждани от родители, които са били F2 след хемизиготно чифтосване и са били на фона на C57Bl/6N. Животните бяха настанени в котила, разделени според пола при 22 ± 1 ° C в рамките на 12 h/12 h цикъл светлина/тъмнина с неограничен достъп до храна и вода. Записите на физиологичните параметри са извършени между 9:00 ч. И 13:00 ч.

Експерименти върху възрастни мишки бяха извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния институт по здравеопазване на САЩ (NIH Publication No. 85–23, ревизирана 1996 г.), разпоредбите на Комитета за грижа за животните на Еразъм MC и Федералния закон за използването на опитни животни в Германия и бяха одобрени от местните власти (Landesamt für Gesundheit und Soziales des Landes Berlin).

Диети

Всички животни са получили нормална вода al libitum и следните видове храна:

Храна I: Стандартна храна; „Ssniff SM/R/N-H (10 mm)“, (калоричност: 12,2 MJ/kg) ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Германия, използван за опити, описани на фигура 1 и фигура 4.

Храна II: („Диета с ниско съдържание на мазнини“): „Altromin Standard-1324“; Алтромин (калоричност: 12,5 MJ/kg; при тази диета 13,6% от конвертируемата енергия се дължи на съдържанието на мазнини), използван за опити, описани на фигура 2a – e.

Храна III: („Диета с високо съдържание на мазнини“): „Altromin C1057“ (калоричност: 14,6 MJ/kg; при тази диета 35,0% от конвертируемата енергия се дължи на съдържанието на мазнини), използвана за експерименти, описани на фигура 2f.

Храна IV: Стандартната храна (вж. По-горе Храна I) беше студено смляна, допълнена с често използвания, добре поносим, ​​орално активен и безвкусен NEP-инхибитор кандоксатрил (Pfizer) [34], [35], смесен и групиран под налягане (2 g/kg); това съответства на дневна консумация от ок. 200 mg/kg/ден. Производството на храни, съдържащи кандоксатрил, се извършва както обикновено от производителя (ssniff/Германия). Използваната контролна храна е приготвена в същия ден от същото ръководство; използвани за експерименти, описани на фигура 4.

ЯМР анализ

Съставът на тялото е измерен чрез ЯМР спектроскопия (Minispec MQ10 NMR Analyzer [Bruker, Billerica, Massachusetts/USA; www.minispec.com] при женски мишки, използвайки софтуер от Echo Medical Systems [Хюстън, Тексас, САЩ]).

Дихателна камера и индиректна калориметрия

Разходът на енергия и метаболитното окисляване на горивата се оценяват от консумацията на кислород, производството на въглероден диоксид и отделянето на азот в урината в метаболитни клетки с отворен кръг, както е описано по-рано от Aust et al. [36]. Концентрацията на кислород във въздуха се измерва парамагнитно, а концентрацията на въглероден диоксид чрез инфрачервена абсорбция. От тези стойности се изчислява дихателният коефициент (RQ). Параметрите се контролират от оборудването на Braun & Hartmann (Minden, Германия) и се съхраняват онлайн за всяка клетка (мишка): Въздушен поток; базова стойност за мишки: 30 Nl/h, извършена от въздушен компресор; Действително съдържание на O2 (об.%); Действително производство на CO2 (ppm); Действително въздушно налягане (hPa).

Индиректната калориметрия се извършва с еднопосочни мишки в домашните им клетки с твърд херметически затворен капак.

Биохимични анализи

Нивата на серумен лептин са измерени чрез ELISA (комплект за имуноанализ на миши лептин Quantikine, MOB00, R&D Systems Inc., Минеаполис, САЩ). Количествата на липидите са определени количествено от оборудването Cholestech LDX (Cholesttech Corp., Hayward, CA, USA) според ръководствата на производителя. Всички животни бяха на възраст от 12 месеца.

Тест за толерантност към глюкоза

Осем женски и 9 мъжки диви видове, както и 10 женски и 9 мъжки NEP-нокаутиращи мишки на възраст 12 месеца бяха тествани за орален глюкозен толеранс. Базалните нива на глюкоза в кръвта след 8-часово гладуване са били тествани преди теста (започвайки 8 часа). След перорално приложение на глюкозен разтвор (1 mg/g телесно тегло) нивата на глюкоза в кръвта са регистрирани след 30 минути, 60 минути, 90 минути и 120 минути. Изследователят беше заслепен за генотипите.

Измерване на активността на NEP

NEP активността е измерена съгласно Winkler et al. [37] с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC) за наблюдение на разграждането на [D-Ala2, Leu5] енкефалин (DALEK, 100 µM) и паралелното образуване на Tyr-D-Ala-Gly в присъствието на аминопептидазния инхибитор бестатин (10 -4 М) и инхибитора на ангиотензин-конвертиращия ензим лизиноприл (10 -6 М). Специфичността на реакцията се характеризира с използване на 10-5 М кандоксатрилат (Pfizer, UK73,967). Неутралната ендопептидазна активност е измерена два пъти във всички проби.

Кахексия

Мъжки ЯМР при мъже: ну/nu мишки на възраст 6 месеца (n = 16) бяха подкожно имплантирани с човешкия панкреатичен карцином PSN-1 и разпределени по еднакъв начин в контролна (стандартна храна) и група за лечение (стандартна храна + кандоксатрил; Храна IV). Растежът на подкожния тумор и теглото на животните се наблюдават ежедневно. Лечението е започнало на ден 1 след инокулация на тумор. Лечението се провежда непрекъснато до ден 23 след имплантиране на тумор (края на експеримента), при което изследователят е ослепен за експерименталните групи. Теглото на черния дроб, далака, бъбреците и тумора беше измерено в края на експеримента.

Експеримент с радиотелеметрия

Седем мишки с дефицит на NEP и 7 контрола от див тип, съвпадащи с възрастта, получиха телеметричен имплант (TA11-PA20; Data Sciences International, Сейнт Пол, Минесота, САЩ) в каротидната артерия, както е описано по-рано от Gross et al. [38]. Накратко, измерено е нулевото изместване на инструмента и единицата е напоена с 0,9% NaCl преди имплантацията. Животните бяха обезболени със смес от кетамин (10 mg/kg) и ксилазин (5 mg/kg). Катетърът на предавателя беше вкаран в аортната дъга през лявата сънна артерия. След това катетърът беше запечатан на място. След внимателна подмяна на червата, тялото на предавателя беше фиксирано върху коремната стена и кухината беше затворена с конци. Всички мишки бяха настанени в отделни клетки в шумозаглушена стая. Започвайки една седмица след операцията, животните се наблюдават в продължение на 3 дни, получавайки контролна диета.

Анализи на данни

Данните бяха анализирани чрез t-тест на Student или ANOVA с повтарящи се мерки, според случая.