Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Метаболитният синдром е клинично състояние, характеризиращо се със системни аномалии, които могат да включват комбинации от абдоминално затлъстяване, инсулинова резистентност или непоносимост към глюкоза, дислипидемия, хипертония и повишена експресия на протромботични и възпалителни маркери (прегледани в [1]). В САЩ и подобни индустриализирани държави затлъстяването, причинено от продължителна консумация на диети с високо съдържание на мазнини и калории, изглежда е основната причина за метаболитен синдром, който е свързан с драстично повишен риск от безброй заболявания, включително тип 2 диабет, сърдечно-съдови заболявания, стомашно-чревни и дихателни затруднения, инсулт и много видове рак (прегледани в [2]). Тъй като толкова много от тези клинични синдроми са свързани и със стареенето, може да се предположи, че затлъстяването и диетата с високо съдържание на мазнини модулират процесите на стареене, за да насърчат и/или ускорят прогресирането на заболяването.

стареенето

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Диети и животни

Всички процедури и протоколи за експериментални животни бяха в съответствие с насоките на NIH за използването на експериментални животни и бяха одобрени от PBRC институционалния комитет за грижи и употреба на животните. Мъжки мишки C57Bl/6 на нарастваща възраст (3-, 12-, 20-месечни) бяха закупени от договорната колония, поддържана от Националния институт по стареене в лабораториите на Чарлз Ривър (Уилмингтън, Масачузетс) и поставени за 16 седмици на западна диета (WD, D12079B), диета с високо съдържание на мазнини (VHFD, D12492) или съответните им диети с ниско съдържание на мазнини (C-WD: 98052602; и C-VHFD: D12450B). WD се състои от 41% мазнини (масло и царевично масло) и 29% захароза, докато VHFD се състои от 60% мазнина (свинска свинска мас), а контролните диети са съставени от 10% мазнини. Всички диети са закупени от Research Diets (New Brunswick, NJ) и са предоставени в гранулирана форма. Всички мишки бяха настанени поотделно в стандартна клетка с 12:12 цикъл светлина: тъмнина и имаха свободен достъп до хранителни състави и вода през цялото проучване. Данните бяха събрани от 2 отделни кохорти от мишки, с общо 9–13 животни във всяка група.

Телесното тегло на всички мишки се измерва редовно през цялото време на излагане на диета. Към края на 16-седмичния период на излагане на диета, телесният състав беше измерен с помощта на Bruker minispec LF90 NMR анализатор във времеви домейн (Bruker Optics, Billerica MA). Всички мишки бяха хуманно евтанатизирани и кортикалните мозъчни тъкани бяха незабавно събрани и съхранени при -80 ° C.

Мерки за активност на NOX

Проби, взети от фронталната мозъчна кора на мишки от различни възрасти/диети, се хомогенизират в буфер с буфер с физиологичен разтвор (рН 7,4), съдържащ коктейл за инхибитор на протеаза (Sigma-Aldrich, Inc., Сейнт Луис, МО) при 4 ° C, и след това се подлага на диференциално центрофугиране за изолиране на мембрани. Мембранните проби (10-25 µg общ протеин) се инкубират с 5 µM луцигенин и 100 µM NADPH и NOX активността се измерва незабавно чрез документиране на светлината, произведена от всяка проба при 37 ° C. Излъчването на светлина се записва от всяка проба на интервали от 10 секунди за точно 3 минути. Специфичната роля на NOX в измерената луминесценция се определя чрез изваждане на фоновото ниво на луминесценция за всяка проба, която се генерира чрез включването на инхибитора на флавопротеина дифенилениодоний (DPI; 1 цМ). NOX активността е представена като среден брой луминесцентни броя в минута (CPM) на микрограм протеин.

Мерки за експресия на протеини чрез Western blot

Взети са тъканни проби от фронталната мозъчна кора на изложени на диета мишки и се хомогенизират в буфер за лизис с буфер с физиологичен разтвор (pH 7,4), съдържащ 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA и коктейл за инхибиране на протеаза (Sigma-Aldrich, Inc .). Пробите се денатурират в SDS и еквивалентни количества протеин се електрофоретично разделят в полиакриламидни гелове и се попиват върху нитроцелулоза. Петната са обработени, като се използват следните първични антисеруми: anti-gp91phox (1: 1000, BD Biosciences Inc., Сан Хосе, Калифорния); анти -p47phox (1: 1000, Millipore, Billerica, MA); анти-GFAP (1: 5000, Abcam Inc., Cambridge, MA); анти-Iba-1 (1: 500, Wako Chemicals USA Inc., Richmond, VA) и анти-тубулин (1: 1000, Wako Chemicals USA Inc.). След инкубация с първични антитела, петна се измиват и се излагат на конюгирани с пероксидаза хрян вторични антитела и се визуализират с помощта на хемилуминесцентна система (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA). Пълните изображения бяха сканирани и денситометрично анализирани за количествено определяне.

За да се осигури точно количествено определяне на множество петна, проби от всички групи в дадена възраст (WD, HFD и CD за двете диети) бяха включени във всяко отделно петно. Данните бяха изчислени като съотношение на експресия спрямо експресия на тубулин, което беше включено като вътрешен контрол на натоварването. След това се изчислява протеинова експресия при WD или HFD мишки и се представя като процентна експресия при CD мишки от същата възраст.

Анализи на протеиновото окисление

Окислителните модификации на протеините бяха оценени чрез количествено определяне на протеиновото карбонилиране в хомогенатите на мозъчната тъкан чрез спектрофотометрични анализи, използвайки модификации на описаните по-рано процедури [23], [24]. Проби от кортикална тъкан от всички мишки се хомогенизират в PBS (рН 7,0), съдържащ протеазен инхибиторен коктейл (Sigma Aldrich, Inc.). Хомогенатите (10 ug от общия протеин) се инкубират с излишък от 2,4-динитрофенилхидразон (DNPH) в продължение на 20 минути, последвано от добавяне на 12% натриев додецилсулфат (SDS). Всеки експеримент включва проби, подложени на процедура за откриване на протеинов карбонил без стъпка на дериватизация (отрицателни контроли). Протеиновите карбонили се определят количествено чрез проследяване на абсорбцията при 370 nm в кварцова 96-ямкова плака с помощта на спектрофотометър и се изчислява, като се използва коефициент на екстинкция от 22.0 M -1 × cm -1 за алифатни хидразони. Данните се отчитат като nmol протеинови карбонили на mg общ протеин.

Хистологични анализи

За хистологични анализи на допълнителен набор от 20-месечни мишки се дава или VHFD, или C-VHFD в продължение на 16 седмици, след което те се перфузират с 4% параформалдехид и мозъците се обработват за вграждане на парафин. Короналните мозъчни секции (6 µm) на нивото на страничната камера са изрязани, събрани и обработени за имунохистохимични анализи. За да се визуализира клетъчното разпределение на експресия на NOX, срезовете бяха двойно маркирани за gp91phox и невронни, микроглиални или актироцитни клетъчни маркери, като се използват следните първични антисеруми: anti-gp91phox (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); анти-NeuN (1: 100, Abcam Inc., Cambridge, MA); анти-Iba-1 (1: 100, Wako Chemicals, Richmond, VA); и анти-GFAP (1: 500, Abcam Inc.). Секциите се инкубират с биотинилирани или свързани с пероксидаза вторични антитела и след това се визуализират, като се използват диаминобензидин (DAB, за gp91 phox) или NOVAred (за NeuN, Iba1, GFAP) като хромагени, следвайки инструкциите на производителя (Vector Laboratories, Burlingame, CA). За документиране на неспецифично оцветяване, първичните антитела са пропуснати от протокола за оцветяване.

За да се визуализира невроналното окисление на протеини, срезите бяха инкубирани с 2,4-динитрофенил хидразин (DNPH) за дериватизиране на протеинови карбонили и след това изследвани с антитела към динитрофенилхидразон (DNP) (Millipore, Billerica, MA) и визуализирани, както е описано по-горе.