Катедра по медицина, Медицински университет в Южна Каролина, Чарлстън, Южна Каролина.

Катедра по клетъчна и молекулярна фармакология и експериментална терапия, Медицински университет в Южна Каролина, Чарлстън, Южна Каролина.

Катедра по клетъчна и молекулярна фармакология и експериментална терапия, Медицински университет в Южна Каролина, Чарлстън, Южна Каролина.

Адресна кореспонденция на: д-р Seok-Hyung Kim, Медицински факултет, Медицински университет в Южна Каролина, сграда за откриване на наркотици, 70 President Street, Чарлстън, SC 29425

Катедра по медицина, Медицински университет в Южна Каролина, Чарлстън, Южна Каролина.

Катедра по регенеративна медицина и клетъчна биология, Медицински университет в Южна Каролина, Чарлстън, Южна Каролина.

Резюме

Въведение

експериментална секция

Риба зебра

Диви тип зебра (щам AB/TU) са закупени от Международния ресурсен център Zebrafish и се поддържат съгласно стандартните протоколи. Процедурите за поддръжка и експерименти за данио са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (IACUC) на Медицинския университет в Южна Каролина (IACUC), номер на протокол AR3324. Рибите се държат в системна клетка (система за многообразно свързване на пречиствателна вода; Tecniplast) при 28 ° C по време на хранене под 14:10 h цикъл светлина: тъмно. Дванадесетмесечни мъжки възрастни риби зебра са били под анестезия с 0,016% (w/v) трикаин и разпределени в две групи (н = 30 във всяка група) с подобни телесни тегла. Рибите се поставят в резервоар от 3 L.

Диети и режим на хранене

Използвахме тетрамин люспи (47% суров протеин; 11,0% сурови мазнини; 3,0% сурови фибри; Tetra-Fish, Inc., Blacksburg, VA) като контролна диета. Обогатена с PA диета за възрастни риби е направена чрез накисване на тетраминова люспичка в разтвор на диетилов етер, съдържащ PA, за да се постигне съдържание на 8% (w/w) PA в храната (допълнителна таблица S1). Етерът се изпарява изцяло в аспиратора за поне 3 дни. Изчислихме количеството PA в диетата, за да постигнем 33% от калориите от мазнините, докато рибите от контролната група получиха 23% калории от мазнините в диетата с тетраминови люспи (допълнителна фигура S1A). Всяка група (н = 15 × 2) е консумирал определената диета (21,6 mg контрол и 20 mg обогатена с PA диета/ден/риба) в продължение на 6 седмици. За да съответстваме на общите калории на хранене между контролната и обогатената с PA диета, хранехме 8% по-голямо количество храна на контролната група.

Вземане на кръв и биохимичен анализ

Взимането на кръв се извършва чрез вкарване на стъклена капилярна игла в гръбната аорта на зебрата, както се съобщава по-рано. 13 Кръв от риба зебра се получава чрез използване на хепаринизирана игла за събиране на кръв по оста на тялото и отзад на ануса в областта на гръбната аорта. Кръв се събира от възрастни рибки зебра след 20-часов период на гладуване и се разрежда 1:10 във фосфатен буферен разтвор. След центрофугиране се събира плазмената супернатанта. Нивото на серумна глюкоза се измерва с Bayer Contour NEXT Diabetes EZ meter (Bayer AG) с помощта на ленти за тест за кръвна глюкоза Contour NEXT. Нивата на TG, общ холестерол (TC) и ALT в разредена плазма се измерват с комплекти съгласно протокола на производителя (кат. № TR22421 за TG; Thermo Scientific, кат. № 439-17501 за TC; Wako, кат. No. A7526 за анализ на ALT; Pointe Scientific).

Чернодробна хистология

Черният дроб се фиксира в 4% параформалдехид от една нощ до 2 дни при 4 ° C. Фиксираният черен дроб се влага в 1,2% агароза/5% захароза и се насища в 30% захароза при 4 ° C за 1-2 дни. Блоковете бяха замразени на повърхността на 2-метил бутан, охладен с помощта на течен азот. Десет микрометров участъка бяха събрани на предметни стъкла на микроскоп, използвайки криостат Leica (Leica CM 1950). Секциите се държат при -80 ° C преди употреба.

Количествена RT-PCR

РНК се изолира от черен дроб на риба данио, използвайки метод Trizol и комплементарната ДНК (cDNA) се транскрибира обратно, като се използва комплект SuperScript III First-Strand (Cat. No. 18080-051; Invitrogen). Общата РНК се екстрахира от три черни дроб, съответно в контролната група и в групата, хранена с РА, и след това същото количество РНК се обединява за синтез на кДНК. Грундирана кДНК на Oligo-dT се приготвя от обща РНК, изолирана с реагент Trizol ® (Кат. № 15596-026; Invitrogen), като се използва надпис III комплект от първа верига (Кат. № 18080-051; Invitrogen). Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR) се извършва с термичен циклер (система CFX96 в реално време; Bio-Rad) с 45 цикъла, използвайки 50 ng cDNA, 200 pmol/μL генно-специфични праймери 14 (допълнителна таблица S2) и SsoAdvanced ™ Universal SYBR ® Green Supermix (Кат. № 172-5274; Bio-Rad). Глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (gapdh) се използва като референция и относителното количествено определяне се изчислява, като се използва метод с двойна делта Ct. qRT-PCR се провежда в поне три екземпляра за всеки ген.

TG анализ

След 6-седмичен диетичен експеримент, пет групи контролирани диетични и PA хранителни риби бяха подложени на гладно през нощта и им беше получен черен дроб. Черен дроб, хомогенизиран в тъкан за хомогенизиране на буфер (250 mM захароза, 25 mM KCl, 0,5 mM EDTA и 50 mM Tris-HCl, рН 7,4) с 1 × протеаза и инхибитор на фосфатазата (коктейл Halt ™ протеаза и фосфатаза, кат. № 78441; Thermo Fisher Scientific) чрез метод на ултразвук. Събрахме лизата и определихме концентрацията на протеин, използвайки Pierce ™ BCA протеинов анализ (Кат. № 23227; Thermo Fisher Scientific); поддържахме лизата при -80 ° C преди TG анализ. Чернодробният TG се измерва с използване на триглицериден реагент (кат. № TR22421; Thermo Scientific). Анализът на състава на мастните киселини в диетата е извършен в Центъра за хранителен анализ на Eurofins (Eurofins Scientific, Inc., Des Moines, IA).

Измерване на вътреклетъчни реактивни кислородни видове

Вътреклетъчните реактивни кислородни видове (ROS) бяха измерени с помощта на OxiSelect. Инвитро ROS/комплект реактивен азот (RNS) от Cell Biolabs (Сан Диего, Калифорния), съгласно протокола на производителя. Лизатите се събират (1 mg/ml) и веднага се подлагат на измерване на ROS/RNS. Интензитетът на флуоресценцията на флуорофорния дихлорофлуоресцеин (DCF), който се образува чрез пероксидно окисление на нефлуоресцентния предшественик дихлордихидрофлуоресцеин (DCFH), беше открит при 480 Ex/530 Em BMG LABTECH CLARIOstar. За разлика от тях, DCFH с лизисен буфер се използва като празна контрола.

Измерване на нива на GSH и GSSG

Количествените определяния на нивата на GSH и GSSG в чернодробните лизати бяха извършени с помощта на метода на ензимно рециклиране. 15 Протеините в екстрактите от контролен диетичен и обогатен с диета хранителен възрастен дроб се утаяват със сулфосалицилова киселина и супернатантата след това се разделя на две епруветки. За намален GSH супернатантът се инкубира с тиоловата флуоресцентна сонда IV и флуоресцентните интензитети се измерват при 400 Ех/465 Em. За общия GSH (GSH + GSSG), супернатантата се неутрализира от триетаноламин и се инкубира с редукционната система (съдържаща NADPH и глутатион редуктаза) при 37 ° С за 20 минути. GSSG се изчислява въз основа на резултатите от намален GSH и общ GSH; съотношението на .

Трансмисионна електронна микроскопия

Черният дроб на зебра се потапя за една нощ в 2,5% глутаралдехид във фосфатен буфер, рН 7,4. Ултратънки срезове (70 nm) се поставят върху медни решетки и се оцветяват с уранил ацетат и оловен цитрат за по 10 минути. Разрезите бяха разгледани с електронен микроскоп JEOL 1010 при 80 kV в различни увеличения. Изображенията са заснети с камера Hamamatsu. Цели процеси бяха извършени в ядрото за електронна микроскопия в MUSC.

Статистически анализ

Статистическата значимост се определя от двустранен студент т-тест със стойност стр

обогатената

Фиг. 1. Оценка на телесното тегло, плазмения TG и нивата на кръвната глюкоза при диета, хранена със зебра, или диета с PA (7% PA). (А) Промени в телесното тегло при възрастни мъже от риба зебра в контролни или PA диетични групи. Стойностите са дадени като средна стойност ± SD. Контролна или PA група: н = 15. (Б) Промени в нивата на кръвната захар (н = 10, всяка група), (° С) промени в плазмените нива на TG (н = 5, всяка група) и (Д) промени в плазмения TC. Лентите за грешки показват SD на средната стойност. *стр

Обогатената с PA диета предизвиква чернодробно увреждане при възрастни зебра

Хепатоцелуларният балон се характеризира с подути хепатоцити с/без ацидофилно тяло (розово оцветяване върху хематоксилин и еозин [H&E]) или хиалин на Mallory и отразява хепатоцелуларното увреждане. Както е дадено на фигура 2, хистологичният анализ на чернодробни участъци, оцветени с H&E, показва балониране на хепатоцити с натрупване на ацидофилен телесен фенотип в групи, хранени с PA (фиг. 2А, В). В допълнение, серумните нива на ALT показват значително увеличение на увреждането на черния дроб след хранене с обогатена с PA диета (Фиг. 2C). Относителната експресия на иРНК на гени, свързани с възпаление (тумор некротизиращ фактор алфа [tnfa] и интерлевкин 1 бета [il1b]), клетъчна смърт (фактор на фрагментация на ДНК субединица алфа [dffa]) и фиброза (колаген, тип I, алфа 1а [col1a1a]) са били значително повишени в групата, хранена с PA, в сравнение с контролната група (фиг. 2D). По този начин, обогатената с PA диета при възрастни рибки зебра имитира хепатоцелуларния фенотип на увреждане, наблюдаван при стеатохепатит.

Фиг. 2. Балониране на хепатоцити със стеатоза и повишаване на увреждането на черния дроб след поглъщане на обогатена с PA диета. Представителни изображения на H&E оцветяване на черния дроб в контрола (А) и PA (Б) диета за 6 седмици. Жълти правоъгълници в левите странични ъгли показваше увеличени гледки към избрани области. Скала = 25 μm. (° С) Плазмени нива на ALT в контрола и PA, хранени с диета от зебра (н = 5). (Д) Относителна експресия на иРНК на tnfa, il1b, dffa, и col1a1a в контрола и PA диета, хранена с диета (н = 5). Лентите за грешки показват SD на средната стойност. *стр

Обогатената с PA диета предизвиква чернодробна стеатоза и увеличава генната експресия, свързана с липидния метаболизъм

Фиг. 3. Генната експресия, свързана с метаболизма на липидите, и нивата на TG в черния дроб при зебрафите, хранени с контролата или диетата PA. (А) Маслено червено O оцветяване на черния дроб от контролна диета и диета PA. Изображенията са представителни по 10 проби за всяка. (Б) Нивото на нивото на TG, измерено от чернодробни лизати на риба зебра от контролни и PA-хранени групи (н = 5, всяка група). (° С) Относителната експресия на иРНК на гени, свързани с липидния метаболизъм, включва srebp1, srebp2, C/EBPa, съгл, fasn, dgat2, ppar-γ, cd36, ldlr, lpin1, и lpl. *стр

Обогатената с PA диета увеличава митохондриалната биогенеза и активността на β-окисляването, което може да доведе до повишен оксидативен стрес в черния дроб на възрастни зебрафи.

Фиг. 4. Митохондриална хомеостаза и свързана с оксидативен стрес генна експресия и нива на GSH, GSSG в контролирани и PA хранени групи. (А) Относителната експресия на иРНК на гени, свързани с митохондриалната хомеостаза, включва drp1, mfn1, opa1, pgc1a, полг, nd1, etfa, и cpt1. (Б) Относителната експресия на иРНК на гени, свързани с оксидативен стрес, включва nox1, nox2, nox5, nrf2, копка2, gsr, gstp1/2, gpx1a, gpx4a, prdx1, prdx4, txnl1, и txnl4. Количествено определяне на (° С) ROS, (Д) GSH, (E) GSSG и (F) Съотношение GSH/GSSG в групите, хранени с контрола и PA. *стр

Обогатената с PA диета предизвиква увреждане на кристите в митохондриите и разширяване на ER в хепатоцитите

В допълнение към увеличаването на оксидативния стрес, драматичното повишаване на opa1 нивото на експресия, дадено на фигура 4А, предполага, че диетата PA може да предизвика митохондриално увреждане, тъй като opa1 може да се предизвика, за да защити структурата на митохондриалните кристали от оксидативен стрес. За да тестваме тази възможност, ние извършихме ултраструктурен анализ в черния дроб на контролни диети, хранени с диета, и PA, хранени с диета (фиг. 5А). Установихме, че е налице натрупване на митохондрии с увредени кристални структури в хепатоцити на PA-хранени зебрафи. По този начин стеатозата и увреждането на черния дроб могат да бъдат резултат от нараняване на митохондриите чрез диета с ПА. Важно е, че групата, хранена с PA, показва широко разширение на ER мембраната в хепатоцитите на PA, хранени с диета от зебра (фиг. 5А, десен панел).

Фиг. 5. Изображения с трансмисионна електронна микроскопия на хепатоцити и експресия на иРНК на гени, свързани с ER стрес. (А) 8 000 × увеличение в черния дроб на контрола и PA диета, хранени с риба зебра за 6 седмици. Увеличените площи при отдолу (жълти правоъгълници) изобразяват нормални митохондрии в контролирани диетични и ненормални митохондрии с увредени кристи в PA-хранения черен дроб на зебра. Показаните изображения са представителни за поне три други чернодробни дробчета. Скала = 800 nm. N (ядро), m (митохондрии), Lip (липидна капчица) и звездички марка за наранени кристи. (Б) Относителна експресия на иРНК на ER стрес/разгънати гени, свързани с протеинов отговор; atf4, gadd45a, ire1, nfkb, xbp1, xbp1-s, atf6, ddit3, оток1, бип, dnajc3, grp94, bim, бида, и baxb. Лентите за грешки показват SD на средната стойност. *стр

Дискусия

Благодарности

Авторите благодарят на д-р Дон К. Роки за полезни коментари и преглед на ръкописа и на д-р Даниел М. Таунсендс за полезни дискусии. Тази работа беше подкрепена от Националните институти по здравеопазване (Общи медицински науки P20GM103542-COBRE в оксиданти, редокс баланс).