Принос от Ян Л. Бреслоу, 4 ноември 2004 г.

мишки

Резюме

Азвъзпалителните процеси играят критична роля в атерогенезата (1). Моноцитите се придържат към съдовата стена и се набират в субендотелното пространство, където се диференцират в макрофаги и впоследствие се развиват в пенообразни клетки (2). Адхезионните молекули и хемокините играят важна роля в ранното развитие на лезиите (3-5). Фракталкинът (CX3CL1) е особено интересен в това отношение, тъй като не само медиира силно свързване на моноцити и Т клетки с ендотела, но може да се отцепи от клетъчната мембрана и да служи като хемокин (6, 7). Фракталкинът се състои от N-краен домен на хемокин, муциноподобна дръжка и трансмембранни и цитоплазмени домени. Металопротеазата ADAM-17 може да разцепи муциноподобната дръжка и да освободи разтворимия хемокинов домен (8). Идентифициран е фракталкинов рецептор, CX3CR1, който е G-протеин-свързан рецептор, който може да медиира адхезията и миграцията на левкоцитите и също така задейства сигнализирането (7, 9).

Както фракталкинът, така и CX3CR1 се експресират в атеросклеротични лезии на хора и мишки (10). Полиморфизмът на CX3CR1, който променя аминокиселинния остатък 249, е свързан с повишен риск от остри коронарни събития (11) и разпространение и тежест на коронарна артериална болест (12). Също така, мишките с дефицит на CX3CR1 са показали, че са намалили атеросклеротичните лезии на сенсибилизиращия атеросклероза аполипопротеинов Е-дефицитен фон (13, 14).

Въпреки това, ефектът на фракталкин върху чувствителността към атеросклероза все още не е докладван. Показано е, че нокаутиращите мишки с фракталкин имат нормална груба анатомия и хематологични профили, с изключение на намаляването на броя на циркулиращите левкоцити, експресиращи маркера на клетъчната повърхност F4/80 (15). Интересното е, че мишките с дефицит на фракталкин са по-малко податливи на увреждане на мозъчната исхемия и реперфузия (16).

Целта на настоящото проучване беше да се изследва ефекта на дефицита на фракталкин върху образуването на атеросклеротични лезии в аортния корен и брахиоцефалната артерия (BCA) в аполипопротеинов Е-дефицит (ApoE -/-) и липопротеин с ниска плътност (LDL) -рецептор (LDLR) -дефицитни (LDLR -/-) мишки.

Методи

Генотипиране на фракталкин. Животните бяха генотипирани за дефицит на фракталкин чрез PCR на геномна ДНК. Както за дивия тип, така и за мутантните алели, използвахме следния често срещан праймер: CX3CL1-com, GCGAAGGAGTCTGCGGGTAGC. Обратните праймери, съответно за дивия тип и за мутантните алели, бяха както следва: CX3CL1-wt, TCACTCCACATTGTGGGAAAGGAA; и CX3CL1-ko, CGTGGGATCATTGTTTTTCTCTTG. PCR продуктите се отделят чрез електрофореза в агарозен гел. Размерите на алелите бяха 415 bp за дивия тип и 563 bp за алекала с фракталкин.

Анализи на кръвта. По време на убийството, пълна кръв е взета чрез левокамерна пункция. За преброяване на кръвни клетки 36 μl пълноценна кръв се разрежда в 144 μl PBS, съдържащ 5% BSA, и се анализира в автоматизиран хематологичен анализатор (Advia 120, Bayer, Wuppertal, Германия), който е калибриран за миша кръв. Липопротеините бяха изолирани чрез последователно ултрацентрифугиране от 60 μl плазма при плътности (d) от 1.063 g/ml (липопротеин с висока плътност) в TL-100 ултрацентрифуга (Beckman Coulter). Холестеролът се определя ензимно с помощта на колориметричен метод (Roche).

Количествено определяне на атеросклероза. За количествено определяне на атеросклерозата в аортния корен, фиксирани с формалин сърца са обработени, както е описано (18). За количествено определяне на атеросклерозата при BCA, вградените в OCT съдове съдове бяха разделени от дисталния до проксималния с дебелина 10 μm. Атеросклеротичните лезии, луминални на вътрешната еластична ламина, са количествено определени в три равноотдалечени маслено червени O-оцветени участъци 200, 400 и 600 μm от точката на разклоняване на BCA в каротидните и субклавиалните артерии.

Имунооцветяване. Замразените секции на BCA се фиксират в ледено студен ацетон (10 минути) и се промиват с PBS. Пероксидазите се гасят с 1% H2O2 (10 минути). Секциите се измиват и блокират с 5% нормален серум (кози серум за CD68 и овчи серум за α-актин и CX3CL1) за 20 минути. Първичните антитела се инкубират в продължение на 60 минути (анти-миши плъх CD68, MAC1957GA, Serotec, разреждане 1: 100; заешки анти-миши α-актин, BT-560, Biomedical Technologies, 1:80 разреждане; и заешки анти-миши CX3CL1, Millennium Pharmaceuticals, 1:80 разреждане). Секциите се измиват и се инкубират с конюгирано с хрян пероксидаза (HRP) вторично антитяло (разреждане 1:50) в продължение на 30 минути (кози анти-плъхове IgG/HRP, STAR 72, Serotec, за CD68; овчи анти-заешки IgG/HRP STAR54, Serotec, за α-актин и CX3CL1). След измиване пероксидазата се визуализира чрез инкубация с Nova Red (Vector Laboratories) и срезовете се оцветяват с хематоксилин. Секциите бяха изсушени и монтирани за постоянно с монтажна среда VectaMount (Vector Laboratories).

Статистически анализ. Всички данни са изразени като средно ± SD, освен ако не е посочено друго. Статистически значимите разлики между две групи бяха анализирани с помощта на тестове на Ман-Уитни или х 2. Статистически значимите разлики между повече от две групи бяха анализирани с помощта на теста на Kruskal-Wallis и последващ тест, за да се определят разликите между всякакви две групи (софтуер за призма, GraphPad). Анализът на ковариацията се изчислява с помощта на ncss софтуер. Стойността на вероятността от ≤0.05 се счита за значима.

Резултати

Област на атеросклеротична лезия при мишки с дефицит на CX3CL1 B6.ApoE -/- на 16-седмична възраст в аортния корен и BCA. Количествените секции в BCA бяха измерени на 200, 400 и 600 μm близо до точката на разклоняване на BCA в субклавиалната и каротидната артерии. (A) Аортна зона на корена при женски мишки B6.ApoE -/-. (B) зона на поражение BCA при женски мишки B6.ApoE -/-. (C) Аортна зона на лезия при мъжки мишки B6.ApoE -/-. (D) зона на поражение BCA при мъжки мишки B6.ApoE -/-. Пръчките представляват средните ± SEM, а броят на животните в отделните групи е даден на стълбовете.

Ефектът на дефицита на фракталкин върху прогресията на атеросклерозата беше изследван и върху LDLR-дефицитния фон. Недостигът на фракталкин няма ефект върху телесното тегло при жените; има обаче значителен ефект при мъжете, който до голяма степен се дължи на намаленото тегло на фракталкиновите хетерозиготни нокаутиращи животни (тест на Крускал-Уолис, P = 0,02; пост-тест на Dunn, P -/- CX3CL1 +/+ мишки, зона на аортна коренна лезия е намален значително при жените с 28% при B6.LDLR -/- CX3CL1 +/- и 35% при B6.LDLR -/- CX3CL1 -/- мишки (101,663 ± 38,987 μm 2 срещу 73,468 ± 28,599 μm 2 и 65,870 ± 24 381 μm 2; тест на Kruskal-Wallis, P = 0,001; пост-тестът на Dunn, мишки с дефицит на P -/- CX3CL1 е независим от тяхното намаляване на общите и LDL-холестерол. В сравнение с мишките B6LDLR -/- CX3CL1 +/+, не е имало значително намаляване на площта на аортния корен при мъжете при фракталкинови хетерозиготни или хомозиготни нокаутиращи мишки (35,936 ± 17,976 μm 2 срещу 29,976 ± 18,056 μm 2 и 32,360 ± 17,890 μm 2, съответно).

Област на атеросклеротична лезия при мишки с дефицит на CX3CL1 B6.LDLR -/- на 16-седмична възраст в аортния корен и BCA. Количествените секции в BCA бяха измерени на 200, 400 и 600 μm близо до точката на разклоняване на BCA в субклавиалната и каротидната артерии. (A) Аортна зона на корена при женски мишки B6.LDLR -/-. (B) зона на поражение BCA при женски мишки B6.LDLR -/-. Пръчките представляват средните ± SEM, а броят на животните в отделните групи е даден на стълбовете.

Зоните на лезии BCA бяха значително по-малки на фона B6.LDLR -/-, отколкото на фона B6.ApoE -/-. Независимо от това, в сравнение с мишки B6.LDLR -/- CX3CL1 +/+, женските мишки B6.LDLR -/- CX3CL1 -/- са имали ≈ 50% намаление на площта на лезия на BCA при 200 μm (11 500 ± 9 969 μm 2 и 4 752 ± 6,637 μm 2; P = 0,02), но не е налице значителна разлика в участъците от 400 или 600 μm (фиг. 2В). Зоните на BCA лезии не бяха количествено определени при мъжки мишки, тъй като лезиите са много по-малки от тези на женските мишки (18) и, в условията на това проучване, не бяха достатъчно големи, за да могат да се направят значими сравнения между различните генотипове.

Област на атеросклеротична лезия при мишки с дефицит на CX3CL1 B6.ApoE -/- на 12-седмична възраст. (A) Аортна зона на корена при женски мишки B6.ApoE -/-. (B) Аортна зона на корена при мъжки мишки B6.ApoE -/-. Пръчките представляват средните ± SEM, а броят на животните в отделните групи е даден на стълбовете. n.s., без значение.

Вероятно фракталкинът участва в образуването на атеросклеротични лезии като адхезионна молекула и хемокин, рекрутирайки моноцити в съдовата стена, които впоследствие се трансформират в макрофаги. Следователно, при контролни и мишки с дефицит на фракталкин, натрупването на макрофаги в BCA при 200 μm проксимално на бифуркацията се определя количествено чрез оцветяване с CD68. При мишките B6.ApoE -/- дефицитът на фракталкин води до 80% намаление на площта за оцветяване на CD68 (30 439 ± 19 729 μm 2 срещу 6 014 ± 9 591 μm 2, P -/- мишки, дефицитът на фракталкин намалява зоната на оцветяване на CD68 с 57 % (12 800 ± 10 605 μm 2 срещу 5 468 ± 7 016 μm 2, P = 0,01) (фиг. 4В).

CD68-оцветена зона на атеросклеротични лезии при BCA при CX3CL1-дефицитни мишки B6.ApoE -/- и B6.LDLR -/- на 16-седмична възраст. (A) Женски B6.ApoE -/- мишки. (B) Женски мишки B6.LDLR -/-.

Представителни серийни разрези чрез BCA на мишки с дефицит на CX3CL1 B6.ApoE -/- на 16 седмична възраст. Маслено червено O оцветяване в мишки CX3CL1 +/+ (A) и CX3CL1 -/- (B). CD68 оцветяване (червено) в мишки CX3CL1 +/+ (C) и CX3CL1 -/- (D). CX3CL1 оцветяване (червено) в мишки CX3CL +/+ (E) и CX3CL1 -/- (F). оцветяване с α-актин (червено) в мишки CX3CL1 +/+ (G) и CX3CL1 -/- (H).

Представителни серийни разрези чрез BCA на CX3CL1-дефицитни мишки B6.LDLR -/- на 16-седмична възраст. Маслено червено O оцветяване в мишки CX3CL1 +/+ (A) и CX3CL1 -/- (B). CD68 оцветяване (червено) в мишки CX3CL1 +/+ (C) и CX3CL1 -/- (D). CX3CL1 оцветяване (червено; под вътрешната еластична ламина, маркирана със стрелки) при мишки CX3CL +/+ (E) и CX3CL1 -/- (F). оцветяване с α-актин (червено) в мишки CX3CL1 +/+ (G) и CX3CL1 -/- (H).

Дискусия

Това проучване показва поразителен ефект от дефицита на фракталкин върху зоната на атеросклеротична лезия в BCA, като само незначителен ефект има върху аортния корен. Недостигът на фракталкин намалява площта на лезията както при женските, така и при мъжките мишки B6.ApoE -/- с до ≈85% в частта от BCA, която е най-близка до неговото раздвояване в каротидната и субклавиалната артерии. За разлика от това, при един и същ генетичен фон по едно и също време, дефицитът на фракталкин няма ефект върху областта на аортните корени при женски или мъжки мишки. Въпреки че дефицитът на фракталкин също намалява площта на аортните корени в по-ранен момент, този ефект е сравнително малък (≈30%) и се наблюдава само при жени. На B6.LDLR -/- -сенсибилизиращия фон, както аортният корен, така и зоните на лезия на BCA са по-малки, а дефицитът на фракталкин намалява площта на аортния корен при женски мишки с ≈35% и в частта от BCA най-близо до неговата бифуркация с ≈50%. На този фон, дефицитът на фракталкин няма ефект върху зоната на лезия на аортния корен при мъжки мишки и няма ефект върху зоната на лезия на BCA в частта на съда, най-близка до аортата при женски мишки. По този начин ефектът на фракталкин върху развитието на атеросклеротична лезия е силно повлиян от локализацията на лезията и сенсибилизиращия фон.

В обобщение установихме, че основният ефект на дефицита на фракталкин върху атеросклерозата е по-скоро на BCA, отколкото на аортния корен. Също така намерихме сериозни доказателства за специфично взаимодействие на фракталкин-фон. Нашите резултати се различават от тези, съобщени за фракталкиновия рецептор, нокаут CX3CR1, но понастоящем не може да се определи дали тази разлика се дължи на разлики в експерименталните условия или някаква степен на неприпокриващи се функции между фракталкин и неговия рецептор.

Благодарности

Благодарим на Адам Д. Перски, Хелън Ю и Сюи Лий за техническа помощ. Тази работа беше подкрепена от Националните здравни институти HL-54591-08 и HL70524-02. D.T. беше сътрудник (DFG Te 342/1-1) от програмата на Deutsche Forschungsgemeinschaft Emmy Noether.

Бележки под линия

↵ § До кого да се адресира кореспонденция на адрес: Университета Рокфелер, Box 179, 1230 York Avenue, New York, NY 10021. E-mail: breslowrockefeller.edu .

↵ † Настоящ адрес: Институт по лабораторна медицина, клинична химия и молекулярна диагностика, Университетска болница Лайпциг, 04103 Лайпциг, Германия.

Принос на автора: D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. и J.L.B. проектирани изследвания; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. и J.L.B. извършени изследвания; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. и J.L.B. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. и J.L.B. анализирани данни; и D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. и J.L.B. написа вестника.

Съкращения: BCA, брахиоцефална артерия; LDL, липопротеин с ниска плътност; LDLR, LDL рецептор.