Клер Дж Уотсън

1 Катедра по ортопедия и спортна медицина, Университет във Вашингтон, Сиатъл, Вашингтон, САЩ

Роналд Й Куон

1 Катедра по ортопедия и спортна медицина, Университет във Вашингтон, Сиатъл, Вашингтон, САЩ

Резюме

Неотдавнашният напредък в геномните, скрининговите и образни технологии предостави нови възможности за изследване на молекулярния и клетъчния пейзаж, лежащи в основата на човешката физиология и болести. В контекста на изследванията на скелета, технологиите за системна генетика, скрининг с висока производителност и изображения с високо съдържание могат да помогнат за безпристрастен подход при търсене на нови биологични, патологични или терапевтични пътища. Тези подходи обаче налагат използването на специализирани моделни системи, които бързо произвеждат фенотип, лесни за манипулиране и подлежащи на оптично изследване, като същевременно представляват костна физиология на бозайници на молекулярно и клетъчно ниво. Появяващото се използване на зебра (Danio rerio) за моделиране на човешки заболявания подчертава неговия потенциал за ускоряване на терапевтичното откриване и откриване на пътеки в скелета на бозайниците. В този преглед ние разглеждаме потенциалната стойност на регенерацията на ребрата на ребра дабра (бърз, генетично подлежащ на проследяване и оптически прозрачен модел на интрамембранозна осификация) като транслационен модел за такива изследвания.

Въведение

Технологичният напредък в мащабните биологични изследвания (включително бързо секвениране на целия геном, високопроизводително химическо откриване и изображения с високо съдържание) обещава да отвори нови мощни пътища за биологично откриване на костите. Потенциалът да се възползвате от тези технологии е пряко свързан с наличието на моделни системи, подходящи за широкомащабни подходи. Zebrafish (Danio rerio) представлява уникална комбинация от генетична гъвкавост, ниска цена, оптична прозрачност, малък размер и лекота на приложение на съединение чрез вода. Тези характеристики превръщат рибите зебра в привлекателен модел за биомедицински изследвания, като улесняват мощни експериментални подходи, които са изключително предизвикателни в други модели на гръбначни модели. Тези подходи включват генетични екрани в мащаб на генома, 1 изображения с високо съдържание на клетъчна динамика, 2 открития in vivo на малки молекули3 и бърз разпит на човешката мутантна генна функция.

остеогенни

Изображения in vivo на костната тъкан и динамиката на клетките по време на регенерацията на перките на зебра (Вляво) Оребрена перка на Zebrafish, подложена на двойно маркиране с флуорохром. Областите на регенерирана кост, маркирани с ализариново червено, но не и калцеин, показват нова кост, регенерирана между 7 и 14 дни след ампутация (d.p.a.). (Вляво вляво) Увеличаването на боксираната област разкрива костната апозиция след израстване. (Вдясно) EGFP експресия в sp7: EGFP зебрата разкрива остеобласти както в естествена, така и в новорегенерирана костна тъкан.

Няколко отлични отзива описват стойността на регенерацията на перките като подлежащ на проследяване модел на регенеративна биология, 18,23,24, както и по-широката полезност на рибните модели за биомедицински изследвания на костите.5,8,10,24 Въпреки това актуализиран преглед на липсват потенциалните приложения за регенерация на перките като модел за растеж и минерализация на костите. В този преглед ние изследваме доказателства за генетични и пътни прилики, по-специално между регенерацията на перките на данио и остеогенната физиология на бозайници. Ние също така обсъждаме нововъзникващите технологии за изображения, които могат да помогнат за подобряването на този модел като модел с висока производителност и високо съдържание за скелетни изследвания. И накрая, ние разглеждаме уникалните експериментални изисквания за генетичен и химичен скрининг в скелета на данио и обсъждаме възможностите за иновации, които могат да помогнат за напредъка на новите подходи за бързи и съдържателни анализи в тази моделна система.

Диференциация и активност на остеобластите

Образуване на бластема и дедиференциация на костните клетки

Изследванията на ключови събития, които позволяват регенерация на придатъци (при перките на зебрата, както и други гръбначни структури като крайници на саламандра и цифри на мишки), са съсредоточени върху образуването на бластема. В допълнение, както плюрипотентността, така и източникът на прогениторни клетки в бластемата са поставени под въпрос (с хипотези, вариращи от клетки в циркулация, резидентни стволови клетки или дедиференцирани клетки). Последните проучвания посочват дедиференцираните остеобласти като значителен принос за бластемалните предшественици при регенерацията на ребрата на зебрата, 28,30, а също и за заздравяването на фрактури в ребрата на черепа и черепа.34 Тези изследвания показват, че дедиференциацията не е нито специфична за процеса (регенерация срещу фрактура), нито местоположение специфични (перка срещу череп). Важно е, че наборът от дедиференцирани остеобласти в бластемата остава ограничен от съдбата и се диференцира изключително в остеобласти по време на регенеративно израстване.

При бозайниците има все повече доказателства, че образуването на кости може да бъде медиирано от ограничени от съдбата прародители в множество контексти. В цифрата на мишката, която може да регенерира P3-, но не и ампутации на ниво P2 (подобно на върховете на цифри при малки деца), е демонстрирано, че пролиферативните клетки се образуват от локален пул от клетки, ограничени от съдбата.35,36 Освен това, проучвания за проследяване на родовете при мишки предполагат, че както поддържането на костите, така и регенерацията се медиират (поне частично) от ограничени от остеолинея прогениторни клетки, 35,37, което показва, че някои случаи на регенерация на костите на бозайници може да не изискват участието на популация от плюрипотентни клетки.

Понастоящем не са разрешени процесите, при които костните клетки на бозайници могат да претърпят дедиференциация. Предполага се, че дедиференциацията е специфична за организми с висок потенциал за регенерация. Въпреки това, миши клетки, изолирани от костни чипове, предоставят доказателства за дедиференциация от остеоцити в ограничени от съдбата предшественици.38 Интересното е, че тези клетки се диференцират в зрели костни клетки при имплантиране in vivo. Проучванията също така документират превръщането на зрели миши костни клетки в остеобласти в резултат на лечение с PTH както in vivo39, така и в култура.40 За разлика от това, при възрастни мишки, проучвания за проследяване на родовете показват, че по-голямата част от остеобластите, медииращи поддържането/ремоделирането на костите не са получени чрез дедиференциация и подмножество от резидентни, ограничени от съдбата предшественици на мезенхимни стволови клетки са източникът на остеобластични клетки по време на зарастване на фрактури.37 Клетките от предампутационната тъкан също са замесени като остеобластни предшественици при регенерация на миши цифри, но дали те са получени чрез дедиференциране или от местен пул на възрастни прародители не е ясно

Въпреки тази контекстна зависимост, скорошно проучване, сравняващо регенерацията на крайниците при два вида саламандра (аксолотл и тритон), разкрива, че източникът на предшествениците на скелетните мускули се различава между тях.41 Авторите установяват, че прогениторните клетки в тритоните са получени от дедиференциране на миофибър, докато аксолотъл предшествениците са получени от резидентни сателитни клетки, като се прави извод, че въпреки че източникът на прогениторни клетки може да се различава, крайната способност на тези клетки да се диференцират в зряла тъкан не се различава. В този контекст остава да се види дали предшествениците на костни клетки, които не са получени от дедиференциация, могат също да участват в медиирана от бластема костна регенерация.

Остеогенни сигнални пътища

Остеобластната диференциация по време на регенерация на перки може да включва подобен панел от канонични маркери на остеобластната диференциация, както при бозайниците и повдига въпроса за степента, до която пътищата, регулиращи тези фактори, също могат да бъдат запазени. Например, BMPs са от основно значение за регулирането на образуването и развитието на костите, вероятно чрез медииране на диференциацията на остеобластите. 42,43 Каноничната BMP сигнализация в костта (вж. Chen et al. 44 за преглед) зависи от SMAD1/5/8 фосфорилирането и регулиране надолу по веригата на транскрипционни фактори, включително RUNX2, OSX и DLX5. При зебрафините е показано, че bmp2b се експресира и регулира скелетогенезата във регенериращите ребра19,29 заедно с други BMP, включително bmp429,45 и bmp6,29. При бозайниците загубата на BMP2 и BMP4 също води до скелетни дефекти, понякога причиняващи тежки остеогенни увреждане, както се вижда при двоен Bmp2/Bmp4 условен нокаут.43 Активиран Smad1/5/8 е открит в регенериращия ребра данио1946 и е посочен при насочване на BMP сигнализиране при диференциране на остеобласти.19 И накрая, наблюдавано е регулиране на dlx5 при регенериране на ребрата от зебра46, въпреки че точната му роля в модулирането на образуването на кости в перката е по-малко ясна.

Сигнализирането на Wnt също има централна роля в остеогенезата при бозайници, 47 и в регенериращата перка на зебра. 19,20,48 Експресия на ортолози за важни остеогенни молекулни играчи на бозайници като LRP5, β-катенин и AXIN2 са открити в регенериращата ребра19, 20,46 в допълнение към ортолозите за мишени надолу по веригата, като CX43,46,49 BAMBI20,46 и TWIST2.19 Освен това е установено, че dkk1b инхибира Wnt сигнализирането и намалява броя на предшествениците на остеобласти в регенериращото ребро.19 При бозайници, каноничната Wnt сигнализация е добре установена, че е от съществено значение за диференциацията на остеобластите. Ролята му в регулирането на образуването на кост в диференцираните остеобласти обаче изглежда много по-ограничена. Доказано е, че миши мутанти със стабилизиран β-катенинов сигнал в диференцирани остеобласти проявяват остеопения чрез промени в резорбцията, а не в образуването. сигнализирането е пространствено ограничено до бластема51 и не се наблюдава в новообразуваната костна тъкан.

Интересното е, че Wnt сигнализиращият инхибитор Sost, който се намира почти изключително в остеоцитите в костите на бозайници, се експресира в бластемата по време на ранната регенерация на перките.20 Докато други кости в скелета на ребрата данио притежават остеоцити, костните лъчи на перките не. видове, остеоцитна и не-остеоцитна кост е наблюдавана в костните лъчи на перката и се предполага, че степента на клетъчност на остеоцитите зависи от дебелината на костния лъч.53 В този контекст важен въпрос е дали изразът на сост или други остеоцитни гени в ребрата на данио отразява дивергентната функция или запазената функция в различни клетъчни типове.

Доказателства за запазена генна функция

Голяма част от настоящите ни познания относно участието на пътищата и физиологиите по време на остеогенезата в регенериращите перки са ограничени до данни за генна експресия. Въпреки че функционалните роли на тези гени се изследват най-добре чрез нокаут/нокдаун модели, в повечето случаи мутантните фенотипове за тези гени в регенериращата перка все още не са изследвани. Няколко мутанти на риба зебра, които имитират нарушения на човешките кости, са характеризирани и могат да помогнат да се създаде прецедент за свързване на данните за експресията и функцията на гените на риба зебра с известни физиологии на бозайници. Идентифицирани са мутанти Zebrafish с молекулярни връзки със скелетни заболявания 10, които могат да бъдат групирани в няколко категории: (i) нарушено краниофациално развитие, (ii) ефекти върху образуването на хрущял или колаген и (iii) променена минерализация и костна плътност.

Паралели с развитието на крайниците

Невромускулно-костна кръстосана препратка

Едно от възможните предимства при използването на регенерация на перки от зебра като модел на остеогенеза е възможността да се направят паралели между идентифицираните скелетни дефицити и фенотипите, приписвани на известни регенеративни сигнални пътища. Например в нашия BTx модел наблюдаваме няколко фенотипични прилики като тези, идентифицирани по-рано при рибите, прилагани циклопамин16 (например, липса на ефект върху ранната регенерация, нарушен растеж по време на късна регенерация и намалени бифуркации на костните лъчи). Впоследствие установихме, че регенеративните дефицити в отговор на BTx са предшествани от свръхекспресия на гените на таралеж/гли път gli1 и ptch1. Последният е известен репресор на Shh сигнализиране, което предполага роля за този път при посредничеството на нервно-мускулната регулация на остеогенните функции в късен етап (например костно узряване и натрупване на минерали) надолу по течението.

Количествено изобразяване на костите в регенериращата перка на зебра

Видимо количествено определяне на натрупването на костни минерали чрез изображения на Rotopol. (а) Изображение на двойно лучене на регенерирана перка (8 d.p.a.), получено с микроскопия на Rotopol. (б) MicroCT изображение на същата перка в а. (° С) Сравнението на пиксели по пиксели на профилите на интензитета в един лъч разкрива висока корелация между измерванията на Rotopol и microCT (с изключение на ставите, където има допълнително двойно пречупване поради междусегментния лигамент; вижте текста за подробности).

Мултимодална образна платформа за бързо и високо съдържание на изображения в регенериращата перка на зебра. (а) Напълно моторизиран микроскоп с флуоресценция и възможности за изобразяване на Rotopol. (1) Камера # 1 (флуоресценция); (2) Камера # 2 (поляризирана светлина); (3) Моторизирано филтърно колело; (4) XY етап с пиезо моторни задвижвания; (5) Моторизиран въртящ се поляризатор. (б) Схематично демонстриране на тръбопровод за изображения за скрининг с високо съдържание.

Генетичен и химичен скрининг по време на регенерация на перки

Заключение

В заключение, костта на рибата данио поддържа голяма част от сложността на костта на бозайниците на структурно, клетъчно, молекулярно и генетично ниво и въпреки това притежава важни разлики. Възникващите стратегии за картографиране на кръстосани видове ще предоставят нови възможности за ефективен превод през физиологията на костите на зебра и бозайници, както и ще идентифицират регенеративните етапи в перката с висока транслационна полезност. Чрез изследване на тези пътища в бърза, генетично подлежаща на проследяване и оптически прозрачна система, регенерацията на перките на зебра може да даде възможност за нови парадигми за бърз анализ и анализ на високо съдържание с потенциал да подобри нашето разбиране за остеогенезата и да ускори костното терапевтично откритие.

Благодарности

Признаваме подкрепата от NIH Grant AR066061, UW Royalty Research Fund Grant A88052 и Университета във Вашингтон, Катедра по ортопедия и спортна медицина.