Допринесе еднакво за тази работа с: Moonju Hong, Jeeyoun Jung

стеатоза

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследване на храните, Gyeonggi-do, Република Корея, Департамент по хранителни биотехнологии, Корейски университет за наука и технологии, Gyeonggido, Република Корея

Допринесе еднакво за тази работа с: Moonju Hong, Jeeyoun Jung

Отдел за фундаментални изследвания на KM, Корейски институт по ориенталска медицина, Yuseong-Gu, Daejeon, Република Корея

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследвания на храните, Gyeonggi-do, Република Корея

Отдел за фундаментални изследвания на KM, Корейски институт по ориенталска медицина, Yuseong-Gu, Daejeon, Република Корея

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследвания на храните, Gyeonggi-do, Република Корея

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследвания на храните, Gyeonggi-do, Република Корея

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследвания на храните, Gyeonggi-do, Република Корея

Отдел за фундаментални изследвания на KM, Корейски институт по ориенталска медицина, Yuseong-Gu, Daejeon, Република Корея

Отдел за свързване на метаболизма и храненето, Корейски институт за изследване на храните, Gyeonggi-do, Република Корея, Департамент по хранителни биотехнологии, Корейски университет за наука и технологии, Gyeonggido, Република Корея

  • Мунджу Хонг,
  • Jeeyoun Jung,
  • Парк Хи-Сук,
  • Така че Мин Лий,
  • Нам-Джо Джонг,
  • Скоро-Хи Ким,
  • Kyoung-Won Lee,
  • Ju-A Lee,
  • Myung-Sunny Ким

Фигури

Резюме

Цитат: Hong M, Jung J, Park H-S, Lee SM, Jeong N-J, Kim S-H, et al. (2017) Отварата Shaofu Zhuyu подобрява чернодробната стеатоза и системно възпаление, медиирани от затлъстяване, чрез регулиране на метаболитните пътища. PLoS ONE 12 (6): e0178514. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178514

Редактор: Анна Алиси, детска болница „Бамбино Гесе“, ИТАЛИЯ

Получено: 21 август 2016 г .; Прието: 15 май 2017 г .; Публикувано: 1 юни 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Корейския институт по източна медицина (K15113 и K15114) и Корейския институт за изследвания на храните (E0150302-2). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Излишният прием на храни с високо съдържание на мазнини води до чернодробна стеатоза, която според източноазиатската медицина се предизвиква от застой на кръв, вътрешно задържане на храчки и влага, стагнация на Qi на черния дроб и недостатъчна функция на далака или бъбреците [6]. Чернодробната стеатоза има няколко причини. Двете основни причини за заболяването са натрупването на хепатоцелуларен триглицерид (TG) в резултат на дисбаланси в усвояването на липидите и хронично възпаление. Чернодробната стеатоза се насърчава от чернодробна липидна дисрегулация, оксидативен стрес, митохондриална дисфункция и хронично системно възпаление, индуцирано иначе от провъзпалителни цитокини, като моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1), фактор на туморна некроза-α (TNF-α), и интерлевкин-6 (IL-6), секретиран от черния дроб и адипоцитите [7, 8, 9, 10, 11]. Възпалението е свързано с важни патогенни механизми, които участват в развитието на свързаната със затлъстяването чернодробна стеатоза и застой на кръвта. В това проучване демонстрирахме ефикасността на SFZYD в модел на чернодробна стеатоза, индуциран от затлъстяване, и изяснихме механизма, в основата на неговите ефекти.

Наскоро метаболомиката привлече интерес към откриването на биомаркери и се оказа полезна за оценка на цялостните терапевтични ефекти на много многокомпонентни фармацевтични продукти и лекарства с TKM или TCM, чиито най-видни характеристики позволяват използването им в холистични подходи, както и за изследване на функцията и дисфункция на живите органи [12]. Тъй като множество съединения взаимодействат с множество цели с взаимозависими дейности in vivo, метаболомиката, съчетана с множество статистически инструменти, фокусирани върху цялостни анализи на малки молекули и биологични пътища, е ценен подход за разбиране на ефектите от традиционните билкови лекарства, тъй като не само позволява изясняване на взаимоотношения между фенотип и метаболизъм, но също така идентифицира ключовите метаболити, свързани с определен фенотип. В това проучване използвахме метаболомичен анализ, за ​​да изследваме полезните ефекти на SFZYD при системно възпаление и чернодробна стеатоза при индуцирани от диета затлъстели мишки (DIO). Ние анализирахме метаболитните фенотипове на тези мишки и използвахме капилярна електрофореза за време на полетна масова спектрометрия (CE-TOF/MS), базирана на метаболитен подход, за да изясним физиологичната функция на SFZYD при затлъстяване.

Материали и методи

Подготовка на SFZYD

Приготвихме отвара SFZYD чрез извличане на смес, съдържаща следните 10 сушени лечебни билки: 4 g Foeniculum vulgare Mill., 0,8 g Zingiber officinale Roscoe, 4 g Corydalis ternata Nakai, 4 g Commiphora molmol Engler, 12 g Angelica gigas N., 4 g Cnidium officinale Makino, 4 g Cinnamomum loureirii Nees, 8 g Paeonia obovata Maxim., 12 g Typha angustifolia L. и 8 g Trogopterus xanthipes. Всички билкови компоненти са закупени от Omniherb (Daegu, Корея) и са инспектирани от Jun-Kyung Lee от диспансера по източна медицина Hyemin, Корея. Отварата се екстрахира от смес от нарязани сурови билки чрез екстракция с обратен хладник (COSMOS-660, Kyungseo Machine CO. Incheon, Корея) в дестилирана вода за 3 часа при 100 ° C. Екстрактът беше лиофилизиран, за да се получи прах (добив на екстракция 13,04%) и след това се съхранява при -70 ° С.

HPLC анализ

(А) HPLC хроматография на SFZYD. (Б) Химични структури на десетте съединения, съставляващи SFZYD. Ключ за хроматографията: 1. албофлорин, 2. пеонифлорин, 3. бензоена киселина, 4. галова киселина, 5. кумарин, 6. канелна киселина, 7. цинамалдехид, 8. 6-гингерол, 9. нодакенин и 10. ферулова киселина.

Животни и диети

Това проучване е проведено в строго съответствие със съответните насоки и е одобрено от Институционалния комитет по грижи и употреба на животните към Корейския институт за изследване на храните (# KFRI-M-14006). Пет седмични мъжки мишки C57BL/6NCrSlc, закупени от Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Япония), бяха настанени в KFRI при контролирана температура (24,0 ± 1 ° C с относителна влажност 50 ± 5%) под 12 часа светли/тъмни цикли и им беше разрешен достъп до храна и вода ad libitum. След адаптиране към горната среда в продължение на 1 седмица, мишките бяха разделени на две групи и хранени с 10% kcal нормална чау диета (NC; D12450B, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) или 60% kcal диета с високо съдържание на мазнини (HFD; D12492) за 8 седмици. След това групата с HFD се разделя на следните две групи: група с HFD, която се прилага орално SFZYD в доза от 100 mg/kg телесно тегло веднъж дневно в продължение на 4 седмици, и група с HFD, на която се прилага вода като контрол на носителя. Телесното тегло и приема на храна се измерват всяка седмица. Кръв се събира от ретроорбиталния синус точно преди мишките да бъдат умъртвени, след което се приготвят серумни проби. След това взетите проби от черния дроб и мастната тъкан от епидидима (AT) се претеглят, незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° C до анализ.

Хистологично изследване

Образци от чернодробна тъкан бяха фиксирани в 4% формалин, вградени в парафин и след това нарязани на 4-μm участъци. Впоследствие срезовете бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E), след което изображения бяха заснети с помощта на посочения микроскоп (ECLIPSE 80i, Nikon, Япония).

Биохимичен анализ на серумни и чернодробни тъкани

Общият брой на белите кръвни клетки (WBC) се измерва с помощта на автоматизиран брояч на клетки (Hemavet 950 FS, Drew Scientific Inc., Waterbury, CT, USA). Серумът се отделя от кръвта чрез центрофугиране при 12 000 оборота в минута за 2 минути и серумните нива на MCP-1 и адипокин се определят с помощта на комплекти за ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA), съгласно инструкциите на производителя. Комплектите адипонектин и лептин са получени от ALPCO Diagnostics (Salem, NH, USA), а комплектът MCP-1 е закупен от Enzo Diagnostics (Farmingdale, NY, USA).

Анализ на серумните метаболити

Анализът на серумен метаболит се извършва от Human Metabolome Technologies, Inc. (HMT; Tsuruoka, Япония). Накратко, серумът се екстрахира, филтрира, центрофугира и след това се подлага на метаболомичен анализ, като се използва капилярна електрофореза Agilent за време на полетна масова спектрометрия (CE-TOF/MS) (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния, САЩ). Всички проби бяха анализирани в катионен и анионен режим. Обработените пикови данни, открити чрез CE-TOF/MS анализ, бяха извлечени с помощта на софтуер за автоматична интеграция (MasterHands, версия 2.13.0.8.h, разработен от университета Keio софтуер), за да се получи следната информация: m/z стойности, времена на мигриране (MTs) и области [13]. Всеки пик се подравнява според времето за миграция на CE и m/z стойностите се определят от TOF-MS. Путативните метаболити са идентифицирани с помощта на подходяща база данни въз основа на m/z и MT данните. Допустимите отклонения бяха ± 0,5 min в MT и ± 10 ppm в m/z, а концентрациите на метаболита бяха изчислени чрез нормализиране на пиковите области до пиковата площ на вътрешния стандарт.

Многовариатен анализ за профилиране на серумен метаболит

Анализ на метаболитния път

Анализът на пътя на метаболита е извършен в MetaboAnalyst Pathway Analysis (http://www.metaboanalyst.ca/Metabo-Analyst/), на базата на източници на бази данни, включително базата данни на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG; http: //www.genome .jp/kegg /), за да се идентифицират, анализират и визуализират метаболитните пътища, засегнати от горните лечения. Стойността р се изчислява чрез анализ на обогатяването, а стойността на въздействието върху пътя (PI) се изчислява чрез анализ на топологията на пътя. Освен това в MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca) е генерирана топлинна карта, която обикновено се използва за ненаблюдавано групиране, като се използват данни, отнасящи се до метаболитите, чиито нива се различават значително между 3-те групи.

Корелационна мрежа

Генерирана е корелационна мрежа, използваща значимите корелации (р стойност ® 480 PCR система в реално време (Roche Diagnostics, Манхайм, Германия), използвайки сонди TaqMan Universal Master Mix II и TaqMan (Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). PCR протоколът включваше следните стъпки: 50 ° C за 2 минути и 95 ° C за 10 минути, последвани от 40 цикъла при 95 ° C за 15 s и 60 ° C за 1 мин. За тези експерименти бяха използвани следните сонди TaqMan: Ccl2 (MCP-1), Tnfα, Il1β, Lpl, Fabp4 (aP2), PPARγ, Ucp2, Cpt1α, Ppargc1α (PGC-1α), Il6, Serpine1 (PAI-1), AdipoQ (адипонектин), лептин, Slc2a4 (GLUT4) и Irs1 (Life Technologies, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). Всеки експеримент се извършва в два екземпляра и относителните нива на експресия на въпросните гени се нормализират до тези на 18S или Tbp иРНК, използвайки метода ΔCt.

Статистически анализ

Всички резултати са изразени като средна стойност ± SEM и са анализирани с помощта на несдвоени t-тестове и еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последвано от сравнение post hoc на Tukey. Разликите се считат за статистически значими при p Фиг. 2. Лечението с SFZYD подобрява индуцираната от HFD чернодробна стеатоза и системно възпаление.

(A) Експериментална схема на лечение с SFZYD при индуцирани от HFD затлъстели мишки (B) Чернодробни нива на TG (C) Представителни чернодробни тъкани, оцветени с H&E (D) Общо нива на WBC в кръвта и MCP-1, нива на адипонектин и лептин в серума. Данните са изразени като средна стойност ± SEM на 6-8 мишки на група. *, p Таблица 1. Фенотипове при HFD-индуцирани затлъстели мишки, лекувани със SFZYD.

SFZYD променя метаболитните модели на индуцирания от HFD модел на затлъстяване

(A) PLS-DA парцели. (Б) Пермутационен тест (повторен 100 пъти). (C) VIP парцел с доверителни интервали с крик, извлечени от концентрациите на посочените серумни метаболити. Във VIP графиката удебелените букви показват метаболитите, които са допринесли значително за модела PLS-DA (VIP> 1), а звездичката (*) показва метаболитите със стойност на р по-ниска от 0,05 в теста ANOVA.

Лечението със SFZYD променя енергийните модели и метаболизма на пурин, пиримидин и ароматни аминокиселини при затлъстели мишки

(А) Анализ на метаболитния път. (B) Визуализация на топлинна карта на метаболитите, чиито нива са значително променени в ANOVA. Ключовете в анализа на метаболитния път показват метаболитния път с — log (p)> 4,5 или PI> 0,1. Анотираният път за всеки метаболит в топлинната карта е пътят с най-висок PI, както се определя от анализа на топологията на пътя.

Лечението с SFZYD регулира експресията на гени, участващи в възпалението, липидния метаболизъм и митохондриалната дисфункция

Чернодробните нива на експресия на mRNA на Ccl2, Tnfα и Il1β, които са свързани с възпалението, са значително намалени и увеличени съответно при третирани с SFZYD мишки HFD и мишки HFD в сравнение с NC мишки (Фигура 5А) и нивата на експресия на mRNA на Lpl, Fabp4 и Pparγ, които са свързани с липидния метаболизъм, са значително намалени след прилагане на SFZYD в съответната група в сравнение с контролната група с HFD (Фигура 5В). В допълнение, промените в нивата на експресия на Ucp2, Cpt1α и Ppargc1α, които са свързани с митохондриална дисфункция в мастния черен дроб, бяха отслабени след приложението на SFZYD (Фигура 5C).

Нивата на тРНК в чернодробната тъкан бяха оценени чрез RT-PCR анализ в реално време. (А) Относителните нива на експресия на гени, свързани с възпалението (Ccl2, Tnfα и Il1β). (B) Относителните нива на експресия на гени, свързани с липидния метаболизъм (Lpl, Fabp4 и Pparγ). (C) Относителните нива на експресия на гени, свързани с митохондриална дисфункция (Ucp2, Cpt1α и Ppargc1α). Данните са изразени като средна стойност ± SEM за 6-8 мишки на група. *, p Фигура 6. Лечението със SFZYD регулира възпалителната и адипокиновата експресия, без да се засяга инсулиновата сигнализация в мастната тъкан.

Експресионните нива на mRNA на няколко възпалителни маркера и адипокини в AT бяха оценени чрез RT-PCR анализ в реално време. (A) Относителните нива на експресия на гени, свързани с възпалението (Ccl2, Il6, Serpine1 и AdipoQ) (B) Относителните нива на експресия на гените, свързани с усвояването на глюкозата и инсулиновата сигнализация (Slc2a4 и Irs1). Данните са изразени като средна стойност ± SEM за 6-8 мишки на група. *, p Фиг. 7. Променените нива на метаболит са свързани с промените в нивата на биохимичния маркер.