Кун Уанг

1 Държавна ключова лаборатория по млечни биотехнологии, Шанхайски инженерен изследователски център по биотехнологии в млечните продукти, Технологичен център на Bright Dairy & Food Co., Ltd., 1518 Jiangchang Road (W), Шанхай, 200436 Китай

2 Wuhan Bright Dairy Co., Ltd., 1 Zhangbai Road, Wuhan, 430040 Китай

Ченджи Ма

1 Държавна ключова лаборатория по млечни биотехнологии, Шанхайски инженерен изследователски център по биотехнологии в млечните продукти, Технологичен център на Bright Dairy & Food Co., Ltd., 1518 Jiangchang Road (W), Шанхай, 200436 Китай

2 Wuhan Bright Dairy Co., Ltd., 1 Zhangbai Road, Wuhan, 430040 Китай

Гуангю Гонг

1 Държавна ключова лаборатория по млечни биотехнологии, Шанхайски инженерен изследователски център по биотехнологии в млечните продукти, Технологичен център на Bright Dairy & Food Co., Ltd., 1518 Jiangchang Road (W), Шанхай, 200436 Китай

3 Синергичен иновационен център по безопасност и хранене на храните, Университет Дзяннан, Уси, 214122 Китай

Чао Чанг

4 Колеж по хранителни науки и инженерство, Политехнически университет в Ухан, 68 Xuefu Road (S), градина Чанцин, Ухан, 430023 Китай

Резюме

Това проучване оценява влиянието на доматения сок, обогатен с пробиотичния щам Lactobacillus plantarum ST-III върху вкусовите и здравословни ефекти на ферментиралото обезмаслено мляко. Бяха изследвани ферментационни параметри като титруема киселинност, брой на жизнеспособни клетки, антиоксидантна активност и летливи компоненти. Броят на жизнеспособните бактериални клетки на 40% проби от доматен сок е значително по-висок от този в контролната група, достигайки пик при 1,09 х 109 CFU/ml след 48 часа, а титруемата киселинност се увеличава с 2,76 пъти спрямо контролната стойност. Антиоксидантната способност на ферментиралото мляко корелира със съдържанието на доматен сок в допълнение към времето на ферментация в тестовете за 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил и редуцираща/антиоксидантна сила на железа; за тези методи дейностите за почистване на 40% проби са били 1,18- и 1,28 пъти по-високи от контролните стойности, съответно, за 24 часа. Нещо повече, изобилие от вкусови компоненти, особено алдехиди, бяха открити след добавянето на L. plantarum ST-III добавен доматен сок.

Въведение

С нарастващата популярност на здравословните диети, здравословните и функционални храни се произвеждат все повече от световната индустрия за производство на храни. Ферментиралите храни като сирене и кисело мляко съдържат различни микроби (Evivie et al., 2017) и играят важна роля в храносмилателните и имуномодулиращите функции. В момента пробиотиците, притежаващи специални хигиенни функции, се добавят към ферментиралата храна, за да повишат нейната стойност. Адекватните количества пробиотици упражняват редица дейности за насърчаване на здравето, като облекчаване на симптомите на непоносимост към лактоза, придържане към слуз на човешки епителни клетки и подобряване на микробния баланс в стомашно-чревния тракт (Argyri et al., 2013; Floros et al., 2012; Yoon et al., 2006).

Lactobacillus plantarum може да оцелее при различни условия на околната среда поради своите факултативни хетероферментативни характеристики. В допълнение, това е един от малкото пробиотици, които могат да колонизират човешката стомашно-чревна лигавица (Sabo et al., 2014). Фармакологичните проучвания показват, че L. plantarum може да отделя плантарицин, което позволява на бактерията да намали скоростта на транслокация на чревни бактерии, да се конкурира с други вредни бактерии и да модулира имунологични и възпалителни фактори (Song et al., 2014) Освен това, концентрациите на фибриноген и холестерол в серума са значително намалени чрез излагане на щамове L. plantarum (Yadav et al., 2016).

Ползите от L. plantarum ST-III, който е изолиран от кимчи, включват модулация на холестерола и колонизация на стомашно-чревната лигавица на човека (Chen et al., 2008; Chen et al., 2010). Въпреки това, той не се размножава добре в млякото и неговата подкиселяваща способност е твърде слаба, за да съсирва млякото (Wang et al., 2011). Според предишни изследвания (Ma et al., 2016), L. plantarum ST-III не може да расте добре в млякото без шест ключови аминокиселини (Ile, Leu, Val, Tyr, Met и Phe) и поне един пурин. Обратно, повечето зеленчуци и плодове съдържат пурини и свободни аминокиселини, което ги прави добри допълнителни кандидати за ферментация на мляко (Kuwaki et al., 2012). Различни изследвания са изследвали зеленчукови и плодови сокове като нар, ябълка и зеле, ферментирали с пробиотични бактерии, включително Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, L. plantarum и Lactobacillus casei (Dimitrovski et al., 2015; Mousavi et al., 2011; Yoon и др., 2006). Чисто ферментиралите плодови или зеленчукови напитки не могат да осигурят животински протеини, които лесно могат да бъдат усвоени от човешкото тяло и по този начин комбинацията от плодове и мляко с двойно ферментирала храна може да бъде по-обещаваща (de Vrese et al., 2011).

Доматът (Lycopersicon esculentum) е популярен и универсален плод с висока хранителна стойност. Поради добрия си вкус и разнообразна употреба, той се превърна в една от най-популярните култури (Ilahy et al., 2011). Доматът е богат на витамини С и Е, ликопен и β-каротин, а също така съдържа някои фенолни съединения (Ilahy et al., 2011). Някои изследователи установиха, че плодово-зеленчуковите продукти, ферментирали с помощта на L. plantarum, могат ефективно да контролират заболявания, предизвикани от консумацията на високо съдържание на мазнини и фруктоза като рак и сърдечно-съдови заболявания, като отслабват дислипидемията; промяна на нивата на провъзпалителни цитокини; и намаляване на дейностите на супероксиддисмутаза, каталаза и глутатион пероксидаза (Huang et al., 2013; Noctor and Foyer, 1998).

Изследване описва чист доматен сок, ферментирал със смес от пробиотици (Sulhvir et al., 2016). Никое проучване обаче не обсъжда параметрите на L. plantarum в смес от домати и мляко. В това проучване към млякото се добавя доматен сок, за да се изследват допълнително ферментационните ефекти на L. plantarum ST-III. Бяха изследвани и антиоксидантните дейности и летливите съединения на ферментиралите продукти.

Материали и методи

Приготвяне на доматен сок

Пресни домати бяха закупени от пазар, почистени и нарязани на парчета преди екстракция с помощта на сокоизстисквачка (HR 1861, Philips China Investment Co., Ltd., Zhuhai, China), последвано от филтриране с марля и центрофугиране при 12 000 × g за 10 мин (5804R, Eppendorf, Хамбург, Германия). След това супернатантата се пастьоризира при 68 ° С за 30 минути и се съхранява при 4 ° С.

Приготвяне на L. plantarum

Lactobacillus plantarum ST-III е получен от Bright Dairy & Food Co., Ltd. (Шанхай, Китай) и първо култивиран в MRS (Merck, Дармщат, Германия) агар при анаеробни условия (Bugbox Anaerobic System, Ruskinn, Bridgend, UK) с 95% N2 и 5% CO2 при 37 ° C. Единичната колония се пречиства два пъти.

Пречистеният L. plantarum ST-III се инокулира в MRS бульон и се култивира до логаритмична фаза. Приготвените култури се центрофугират (10 000 × g, 10 минути), последвано от промиване два пъти със стерилен физиологичен разтвор (0,85%, тегл./Тегл.), И след това с помощта на физиологичен разтвор културите се суспендират отново и се регулира абсорбцията до OD600 = 0,7 (около 1 × 10 8 CFU/ml).

Приготвяне на мляко за ферментация с доматен сок

Обезмасленото мляко на прах (33,4% протеини и 0,8% мазнини; Fonterra Ltd., Окланд, Нова Зеландия) се разтваря в дестилирана вода. Различни концентрации на проби от обезмаслено мляко бяха допълнени с 0%, 20% или 40% (w/w) доматен сок, за да се поддържа крайна концентрация на обезмаслено мляко от 12% (w/w). Сместа се смесва с помощта на бъркалка RW20 (IKA, Staufen, Германия) и след това се стерилизира при 110 ° С в продължение на 5 минути и пробите се инокулират с подготвени бактерии при крайна концентрация 1 × 10 7 CFU/ml (десеткратно разреждане) ) след охлаждане до 37 ° C.

За всяка проба бяха създадени четири повторения и един набор беше използван за наблюдение на промените в рН. Останалите проби бяха инкубирани при 37 ° С за 24, 48 или 72 часа, последвано от съхранение при 4 ° С преди анализ.

Ферментограф на L. plantarum

Приготвя се стерилно мляко, смесено с различни количества доматен сок, и рН се следи с помощта на системата Cinac (Alliance Instruments, Mery-Sur-Oise, Франция) по време на подкисляването в продължение на 72 часа.

Изброяване на L. plantarum

Методът за броене на плочки се използва за изброяване на жизнеспособните клетки на L. plantarum. Пробите се разреждат серийно, като се използва стерилен физиологичен разтвор, за да се получат 30–300 колонии върху MRS плочи от агар. Lactobacillus plantarum се култивира анаеробно под 95% N2 и 5% CO2 при 37 ° C в продължение на 48 часа.

Определяне на титруемата киселинност

Титруемите киселинности (TA) на пробите при различно време на ферментация се определят, както е описано по-рано (Yang et al., 2012) с леко изменение. Накратко, 10 g проби се разреждат с 20 ml дестилирана вода и се титруват с 0,1 mM NaOH, като се използва фенолфталеин като индикатор. Количеството консумиран NaOH се умножава по 0,9 за превръщане в% млечна киселина.

Определяне на антиоксидантния капацитет

2,2-Дифенил-1-пикрилхидразил радикална активност на извличане

Методът за измерване се основава на предварително описан протокол (Burda and Oleszek, 2001) с леки модификации. Накратко, 0,1 ml от тестовата проба бяха добавени към 3,9 ml от 2,2 дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) разтвор (0,004 g DPPH, разтворени в 100 ml 95% етанол ) и сместа се инкубира в продължение на 30 минути при стайна температура (26 ° С) на тъмно. След това сместа се центрофугира при 1500 × g в продължение на 10 минути, последвано от измервания на абсорбцията при 517 nm срещу празна контрола (етанол), използвайки UV спектрофотометър (UV6x Series; Bluwave, Шанхай, Китай). Процентът на инхибиране се изчислява, както следва:

където Acontrol е абсорбцията на 0,1 ml от разтворителя. Получена е стандартна крива чрез измерване на DPPH активността на извличане на 50, 100, 200 и 400 mg/L Trolox. Всички проби трябваше да достигнат 50% инхибиране. Антиоксидантният капацитет (AOC) се изчислява спрямо този на Trolox и се изразява като еквиваленти на Trolox-μmol TE/100 g проба.

Анализ за намаляване на железния/антиоксидант

Редуциращата активност на железа е открита съгласно Oyaizu (1986) с лека модификация. Накратко, 1 ml от всяка проба се смесва добре с 2,5 ml фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (0,2 M, рН 6,6) и 1 ml 1% (w/v) калиев ферицианид (K3Fe (CN) 6) (Sinopharm Chemical Reagent Co ., Ltd., Шанхай, Китай) решение. Сместа се инкубира във водна баня при 50 ° С в продължение на 20 минути, последвано от незабавно охлаждане до стайна температура. След това се добавят 2 ml 10% (w/v) трихлороцетна киселина (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.). След центрофугиране при 3500 оборота в минута в продължение на 10 минути, 2,5 ml супернатант се смесват добре с 2,5 ml дестилирана вода и 0,5 ml 0,1% (w/v) FeCl3 · 6H2O (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.) за 2 минути. След това абсорбцията на пруски син разтвор се определя при 700 nm спрямо празния разтвор. По-високите стойности на абсорбция показват по-силна редуцираща активност. Стандартната крива беше изчислена, както е описано за анализа на DPPH.

Определяне на летливи съединения

Ферментирало и неферментирало мляко, съдържащо 40% доматен сок и контролни проби бяха подложени на анализи на летливи съединения. Летливите компоненти на пробите бяха извлечени с помощта на микро-екстракция с твърда фаза и бяха открити чрез газова хроматография-мас спектрометрия. За откриване са използвани газов хроматограф Agilent 7890A (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и масов селективен детектор Agilent 5975C.

Пробите се балансират за 35 минути и се екстрахират за 1 s при 50 ° С. DB-Wax колона (30 m × 0,25 mm × 0,25 mm; Agilent Technologies) беше използвана за отделяне на летливите съединения. Температурата на колоната се поддържа при 40 ° С в продължение на 1 минута, нараства с 20 ° С/мин до 230 ° С и се държи при тази температура в продължение на 5 минути. Носещият газ е хелий (1 mL/min) под налягане (2.4 kPa) и разделен (1:10) условия. Масспектрометърът беше пуснат в режим на електронно въздействие при 70 eV. Обхватът на сканиране на масата беше 35–500 m/z. Съответните данни бяха събрани чрез сравняване на времената на задържане с тези на стандартите.

Статистически анализ

Всички експерименти бяха организирани в напълно рандомизиран дизайн. Всяко лечение е повторено три пъти. Данните бяха представени като средно или средно ± стандартно отклонение и бяха анализирани с помощта на теста на Дънкан за многократен обхват (p 1. Контролната група показа изключително слабо подкисляване и стойностите на рН варираха от 6,51 до 6,06. С увеличаване на съдържанието на доматен сок, стойностите на рН намалява бързо до по-малко от 5,00 в рамките на 24 ч. Резултатите предполагат, че доматеният сок стимулира L. plantarum ST-III-медиирана ферментация в обезмаслено мляко.

ферментация

Промени в рН на всяка проба с доматен сок (0%, 20%, 40%)

Стойностите на TA на пробите по време на ферментацията са илюстрирани на фиг. 2. Стойностите на TA във всички проби от доматен сок са значително по-високи (p 3). Броят на клетките също се увеличава с увеличаване на съдържанието на доматен сок. Най-високият брой на клетките на 48 h е регистриран в групите с 20% и 40% доматен сок (съответно 6,88 × 10 8 CFU/ml и 1,09 × 10 9 CFU/ml), но не са наблюдавани разлики между групите на 24 h . Броят на клетките намалява след 48 часа, особено в групата на 40% доматен сок (4.48 × 10 8 CFU/mL) (р. 4. DPPH активността на почистване и намаляващата сила на железа и двете се увеличават значително с увеличаване на съдържанието на доматен сок (p 4 A). В анализа за намаляване на ферома/антиоксидантна сила, редуциращата мощност е значително (p 4 B). След това способността за изчистване намалява с времето.

Сравнение на антиоксидантния капацитет (μmol TE/100 g) на пробите по време на ферментацията (0 h, 24 h, 48 h, 72 h). Баровете с различни букви означават различни значими (стр. 1. AOC на доматения сок намалява с увеличено време на ферментация при всеки метод. Това откритие предполага, че антиоксидантните вещества в домата играят важна роля за амплификацията на L. plantarum ST-III в млякото. Hervert -Hernandez et al. (2009) установяват, че някои антиоксиданти са субстрати за растежа на микроорганизмите.Това също обяснява защо антиоксидантната активност намалява по време на последната фаза на ферментация, както е посочено в анализа за намаляване на ферома/антиоксидантната сила.

маса 1

AOC способности на ферментирал доматен сок (μmol TE/100 g)

Метод 0 h24 h48 h
DPPH68,07 ± 0,2347,62 ± 1,0334,26 ± 0,18
Намаляване на железа224,01 ± 2,05156,34 ± 1,4998,36 ± 5,27

Всички стойности са средни за три повторения ± SD

Като цяло добавянето на доматен сок към млякото е повлияло до известна степен на AOC. AOC на ферментиралото мляко от доматен сок са много по-високи от тези на ферментиралото мляко от чист домат, вероятно поради хидролиза на протеини и консумация на антиоксиданти по време на ферментацията. Анализът на DPPH е по-подходящ за откриване на липофилни съединения. Triantis et al. (2007) предполагат, че анализът на DPPH не е чувствителен към аминокиселини, докато е подходящ като тест за Cys или Cys пептиди. Анализът на DPPH е тест за радикално изчистване на капацитета, докато анализът за намаляване на ферома/антиоксидантната сила се фокусира върху общата антиоксидантна способност. Това обяснява и разликите в стойностите.

Летливи ароматични съединения на мляко, ферментирало от L. plantarum ST-III

Тъй като L. plantarum ST-III не може да расте добре в чисто обезмаслено мляко, ние избрахме три групи за откриване на летливи органични съединения. Летливите съединения, открити в контролната група и групите от доматен сок, са представени в таблица 2. 20-те открити съединения се състоят от три алкохола, осем алдехида, три карбоксилни киселини, три кетона и три други съставки.

Таблица 2

Резултати от проби на летливи съединения, показващи осреднените пикови площи (в произволна единица × 1000)