научна статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Контекст: Силимаринът е основният флавоноид, извлечен от бял трън, който се използва за лечение на чернодробни заболявания.

статия

Обективен: The in vivo изследван е ефектът на силимарин върху HFD-индуцирана инсулинова резистентност и затлъстяване на черния дроб при мишки.

Материали и методи: Мъжки мишки C57BL/6 са хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD), за да се предизвика затлъстяване и инсулинова резистентност, и са лекувани с 30, 60 mg/kg силимарин в продължение на 18 дни. Изследвани са приемът на храна, телесното тегло и съдържанието/хистологията на епидидималната мастна тъкан и чернодробната тъкан; изчислено е съдържанието на липиди, AST, ALT и възпалителни цитокини в серума.

Резултати: Прилагането на силимарин причинява загуба на телесно тегло при мишки, предизвикани от затлъстяване (DIO) (HFD група: 47,7 g, група от 60 mg/kg: 43,0 g), докато приемът на храна остава непроменен. Силимарин (60 mg/kg) значително намалява епидидималната мастна маса (от 1,75 g на 1,12 g). Повишените плазмени липиди (TC 6.1 mM, TG 1.3 mM, LDL 1.2 mM) при DIO мишки бяха потиснати от силимарин (TC 4.5 mM, TG 0.89 mM, LDL 0.9 mM), както и от инсулин (5.1 ng/ml в HFD група до 2,0 ng/ml (60 mg/kg силимарин). Изследването на нивата на цитокини (TNF-α, IL-1β и IL-6) във всяка група доказа, че лечението със силимарин значително намалява възпалението при DIO мишки. И накрая, силимарин ефективно защитава черния дроб от индуцирано от HFD нараняване, което се доказва чрез намаляване на хистологичното увреждане и намаляване на нивата на ALT и AST, както следва: ALT; 47,4 U/L в групата на HFD до 28,4 U/L (60 mg/kg силимарин); AST; 150,1 U/L в HFD група до 88,1 U/L (60 mg/kg силимарин) в серум.

Дискусия и заключение: Нашите резултати предполагат, че индуцираното от силимарин облекчаване на възпалителния отговор може да бъде механизъм, отговорен за неговите ползи срещу увреждане на черния дроб и инсулинова резистентност.

Въведение

Диабетът е сериозна и нарастваща глобална тежест за здравето в световен мащаб, тъй като се очаква да нарасне 592 милиона до 2035 г. (Forouhi & Wareham 2014; Guariguata et al. 2014). Диабетът тип 1 и тип 2 са двата основни типа, като диабетът тип 2 представлява по-голямата част (> 85%) от общото разпространение на диабета. Инсулиновата резистентност, отличителна черта на диабет тип 2, се свързва със затлъстяването. Затлъстяването води до състояние на хронично, нискостепенно възпаление, което допринася за инсулинова резистентност (Kahn & Flier 2000; Tateya et al. 2013; Minihane et al. 2015). Инсулиновата резистентност възниква при неадекватен отговор на периферните тъкани към нормалното ниво на циркулиращ инсулин за регулиране на хомеостазата на глюкозата в цялото тяло. Установено е, че хроничното възпаление е тясно свързано с индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност (Shoelson et al. 2006; Shoelson SE et al. 2007). Провъзпалителните цитокини като фактор на туморна некроза-α (TNF-α) могат да причинят инсулинова резистентност в мастната тъкан, скелетните мускули и черния дроб чрез инхибиране на трансдукцията на инсулинов сигнал (Hotamisligil et al. 1993; Rui et al. 2001). Освен това, медиираното от инфламазома производство на интерлевкин 1β (IL-1β) също допринася за инсулиновата резистентност (Vandanmagsar et al. 2011; Wen et al. 2012; Jourdan et al. 2013).

Силимаринът е флавоноиден комплекс, съдържащ силибин, силидианин и силихризин, които са получени от семената на бял трън, Silybum marianum (Сложноцветни, Silybum marianum род, Asteraceae). Силимаринът има много силна антиоксидантна активност, която може да предпази черния дроб както от остра, така и от хронична токсичност и нараняване (Gillessen et al. 2014; Abdel-Moneim et al. 2015; Luangchosiri et al. 2015; Wu et al. 2015). Също така, силимаринът може да потисне различни възпалителни реакции чрез потискане на NF-κB пътя. Например, силимаринът ефективно потиска туморогенезата чрез подобряване на оксидативния стрес и дерегулиращо активиране на възпалителни медиатори (Wu et al. 2008; Toyoda-Hokaiwado et al. 2011). Силибин инхибира индуцираните от липополизахаридите (LPS) морфологични промени и производството на провъзпалителни цитокини чрез инхибиране на NF-κB сигнален път (Kim et al. 2015; Lovelace et al. 2015). В допълнение, силимаринът може да подобри индуцираните от фруктоза метаболитни аномалии при плъхове (Prakash et al. 2014). В това проучване установихме, че силимаринът облекчава затлъстяването и инсулиновата резистентност, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HFD), като намалява нивото на възпаление при висококалоричен модел на затлъстяване.

Материали и методи

Агенти

Силимарин е закупен от Selleck (Хюстън, Тексас). Комплекти за холестерол (TC), триацилглицерол (TG), липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-C), липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL), глутамин-оксалацетна трансаминаза (AST), глутамин-пирови трансаминаза (ALT) са закупени от Нанкин Jiancheng Company (Нанкин, Китай). Човешки инсулин (Novolin) за in vivo лечение е закупено от Novo Nordis (Копенхаген, Дания). Комплект Elisa за миши инсулин е закупен от ALPCO (Илинойс, САЩ). Комплектите Elisa за мишки TNF-α, IL-1β, IL-6 са закупени от R&D (Минеаполис, MN). Всички други химикали са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури).

Експерименти с животни и лечение с наркотици

Мъжки мишки C57BL/6, на възраст 6-8 седмици, бяха закупени от Лабораторния център за животни в Шанхай при Китайската академия на науките. Мишките са били държани в животновъдно съоръжение при стандартни лабораторни условия в продължение на 1 седмица преди експериментите, с вода и стандартно подаване на чау. Хуманното отношение към животните и експерименталните процедури бяха проведени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (Министерство на науката и технологиите на Китай, 2006 г., № 398). Мишките са били хранени или с нормална диета с чау (NCD), или с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (40% мастни калории) в продължение на 14 седмици и са имали свободен достъп до вода и храна. Едновременно с HFD, силимарин (30, 60 mg/kg) се дава през устата още 3 седмици. Теглото на тялото се проследява ежедневно, преди да бъде жертвано. Мишките бяха подложени на тест за толерантност към инсулин (ITT) и тест за толерантност към глюкоза (GTT). Глюкозата в кръвта се измерва, както е посочено. След експерименталния период мишките бяха умъртвени и масата на епидидималната мазнина беше претеглена (представлява за мастна маса). Черният дроб се събира за хистологичен анализ и екстракция на иРНК.

Тест за инсулинов толеранс (ITT) и глюкозен толеранс (GTT)

За ITT мишките се гладуват в продължение на 4 часа и след това се инжектират интраперитонеално с инсулинов разтвор в доза от 0,8 IU/kg. За GTT мишките са гладували цяла нощ (~ 12 часа). На следващата сутрин мишките се инжектират интраперитонеално с глюкозен разтвор в доза от 1,1 g/kg телесно тегло. Кръвната глюкоза се измерва с помощта на глюкометър Free Style Lite.

Хистологичен анализ

За да се характеризират хистологичните промени, черният дроб и мастната тъкан от четири животни във всяка експериментална група бяха фиксирани с 10% буфериран формалин, вграден в парафин и след това разделени. Хистопатологичното проучване беше проведено с използване на H & E оцветени секции.

Анализ на чернодробните чернодробни функции и анализ на липидите в кръвта

Серум, взет от мишки от всяка група, е използван за анализ ALT, AST, TC, TG, LDL, HDL, инсулин и цитокини съгласно инструкциите на производителя.

Количествена RT-PCR

Общата РНК от всяко животно се извлича от черния дроб или мастната тъкан, използвайки TRIzol (Takara, Dalian, Китай). Пробите от РНК се обръщат към cDNA и се анализират чрез количествена PCR и относителната експресия на специфични гени се определя с помощта на PCR master mix в реално време (Roche, Базел, Швейцария) с помощта на ABI 7900 PCR система в реално време. Актиновият ген се използва като ендогенен контрол за нормализиране на разликите в количеството на общата РНК, присъстваща в пробите. Използвани са PCR праймери, както следва:

TNF-α, 5′-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3 ′ (напред), 5′-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3 ′ (назад);

IL-1β, 5′-CTTCAGGCAGGCAGTATCACTC-3 ′ (напред) и 5′-TGCAGTTGTCTAATGGGAACGT-3 ′ (назад);

IL-6, 5′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3 ′ (напред) и 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGT T -3 ′ (назад); β-актин, 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3 ′ (напред) и 5′-TTTGATGTCACGCACGATTT-3 ′ (обратно).

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. ANOVA с post hoc две сравнения се използват за оценка на разликите между различни експериментални и контролни групи. стр Стойности под 0,05 се считат за значими.

Резултати

Силимаринът подобрява натрупването на мазнини при DIO мишки

В това проучване използвахме миши модел на HFD-индуцирано затлъстяване, за да оценим ефекта на силимарин. Мишките са били хранени с HFD или нормална чау диета (NCD) в продължение на 14 седмици. Теглото на мишките, хранени с HFD, е значително по-високо в сравнение с групата с NCD. Едновременно с HFD, силимарин (30, 60 mg/kg) се дава през устата през последните 3 седмици. Както е показано на Фигура 1 (а), приложението на силимарин до известна степен е причинило загуба на телесно тегло при мишки, предизвикани от затлъстяване (DIO) (от 47,7 до 43,0 g), докато приемът на храна във всяка група няма разлика (Фигура 1 (b )). Епидидималната мазнина беше взета, претеглена и нормализирана за телесната маса (Фигура 1 (c – e)). 60 mg/kg силимарин значително намалява епидидималната мастна маса (от 1,75 до 1,12 g) и мастния индекс (от 4,6 до 3,2%) при DIO мишки.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Силимарин подобрява натрупването на мазнини при HFD-индуцирани мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12-часово гладуване. Регистрирани са телесно тегло (а) и прием на храна (б). в) Епидидималната мастна маса е събрана и претеглена (d) и нормализирана за общата телесна маса (e). Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Фигура 1. Силимарин подобрява натрупването на мазнини при HFD-индуцирани мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12-часово гладуване. Регистрирани са телесно тегло (а) и прием на храна (б). в) Епидидималната мастна маса е събрана и претеглена (d) и нормализирана за общата телесна маса (e). Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Силимарин подобрява индуцираното увреждане на черния дроб и инсулиновата резистентност чрез намаляване на възпалението при мишки

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Силимарин потиска нивата на липидите в кръвта при индуцирани от HFD мишки със затлъстяване. (а) Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12-часово гладуване. (a – d) Серумът се събира за анализ на TC, TG, LDL и HDL. д) Епидидималната мазнина е събрана и оцветена с H&E. Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Фигура 2. Силимарин потиска нивата на липидите в кръвта при индуцирани от HFD мишки със затлъстяване. (а) Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12-часово гладуване. (a – d) Серумът се събира за анализ на TC, TG, LDL и HDL. д) Епидидималната мазнина е събрана и оцветена с H&E. Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Силимарин подобрява индуцираното увреждане на черния дроб и инсулиновата резистентност чрез намаляване на възпалението при мишки

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Силимарин подобрява чернодробно увреждане, причинено от HFD. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12 часа гладуване. (а) Определени са нивата на ALT и AST в серума. (b) Показано е оцветяване на хематоксилин и еозин в черния дроб (400 ×). Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Фигура 3. Силимарин подобрява чернодробно увреждане, причинено от HFD. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици, последвано от 12 часа гладуване. (а) Определени са нивата на ALT и AST в серума. (b) Показано е оцветяване на хематоксилин и еозин в черния дроб (400 ×). Стойностите са средни стойности ± SD (н = 8). *стр Силимарин подобрява индуцираното увреждане на черния дроб и инсулиновата резистентност чрез намаляване на възпалението при мишки

Публикувано онлайн:

Фигура 4. Силимарин намалява инсулиновата резистентност при HFD-индуцирани мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици. Тест за инсулинова толерантност (ITT) се извършва след 4-часово гладуване и мишките получават 0,8 U/kg телесно тегло инсулин (i.p.). Регистрирана е концентрация на глюкоза. (b) За GTT, 1,1 g/kg телесно тегло глюкоза се прилага чрез интраперитонеална инжекция. Кръвната глюкоза беше измерена между 0 и 120 минути по-късно. Стойностите са представени като средни стойности ± SD (н = 8). *стр Фигура 4. Силимарин намалява инсулиновата резистентност при индуцирани от HFD мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици. Тест за инсулинова толерантност (ITT) се извършва след 4-часово гладуване и мишките получават 0,8 U/kg телесно тегло инсулин (i.p.). Регистрирана е концентрация на глюкоза. (b) За GTT, 1,1 g/kg телесно тегло глюкоза се прилага чрез интраперитонеална инжекция. Кръвната глюкоза беше измерена между 0 и 120 минути по-късно. Стойностите са представени като средни стойности ± SD (н = 8). *стр Силимарин подобрява индуцираното увреждане на черния дроб и инсулиновата резистентност чрез намаляване на възпалението при мишки

Публикувано онлайн:

Фигура 5. Силимарин противодейства на възпалението при HFD-индуцирани мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици. (а) TNF-a, IL-6 и IL-1β в серум са тествани чрез ELISA. (b, c) нивата на тРНК на TNF-α, IL-6 и IL-1β в черния дроб (b) и епидидималната мазнина (c) бяха изследвани чрез RT-PCR. Стойностите са представени като средни стойности ± SD (н = 8). *стр Фигура 5. Силимарин противодейства на възпалението при индуцирани от HFD мишки със затлъстяване. Мишките бяха хранени с NCD или HFD в продължение на 14 седмици, след това третирани със силимарин в продължение на 3 седмици. (а) TNF-a, IL-6 и IL-1β в серум са тествани чрез ELISA. (b, c) нивата на тРНК на TNF-α, IL-6 и IL-1β в черния дроб (b) и епидидималната мазнина (c) бяха изследвани чрез RT-PCR. Стойностите са представени като средни стойности ± SD (н = 8). *стр 2000; Saltiel 2000). Нашите резултати показаха, че приложението със силимарин намалява общото телесно тегло, докато няма ефект върху чистата телесна маса, намалява серумните нива на TC, TG и LDL и подобрява инсулиновата резистентност при мишки със затлъстяване. Междувременно намаляването на кръвната глюкоза на гладно и нивото на инсулин очевидно се наблюдава при DIO мишки, лекувани със силимарин. Експериментите с GTT и ITT демонстрират, че силимаринът значително подобрява глюкозния толеранс и чувствителността към инсулин. Тези резултати предполагат, че силимаринът може да бъде кандидат за лечение на инсулинова резистентност.

Инсулиновата резистентност е често срещано патологично състояние, при което прицелните тъкани не реагират правилно на физиологичното ниво на инсулин. Сред тези тъкани черният дроб е много чувствителен към инсулин и той е важен регулатор на хомеостазата глюкоза-гликоген, поради което той предшества други органи да развият инсулинова резистентност, предизвикана от затлъстяване (Bugianesi et al. 2005). Следователно, като важна тъкан за хомеостазата на глюкозата в цялото тяло, изследването на патогенезата на инсулиновата резистентност в черния дроб може да бъде от полза за лечението на диабета и свързаните с него усложнения. В нашето проучване чернодробното увреждане е оценено с хистологични и биохимични параметри. Нашите резултати тук показват, че при HFD група са наблюдавани очевидни чернодробни увреждания и чернодробна стеатоза. Силимарин може да подобри степента на чернодробна стеатоза и възпаление в чернодробната тъкан и да намали нивата на серумни ALT, AST. Резултатите предполагат, че силимаринът може ефективно да инхибира индуцирания от HFD мастен черен дроб и да подобри чернодробната функция. Нашите резултати са в съгласие с данните, получени с модел на плъх (Zhang et al. 2013).

Все по-често се признава патогенната роля на възпалението в инсулиновата резистентност. Няколко фактора като оксидативен стрес, възпаление, глюкотоксичност, липотоксичност и дисрегулация на адипокин са замесени в генезиса на инсулинова резистентност (Shoelson et al. 2007; Piya et al. 2013). Доказано е, че възпалителните цитокини играят важна роля в регулирането на хомеостазата на глюкозата и инсулиновата резистентност. Ненормалните промени в тези цитокинови профили могат да намалят инсулиновата чувствителност на отдалечени инсулиночувствителни органи, включително черния дроб. Възпалението на мастната тъкан допринася за инсулиновата резистентност чрез провъзпалителни цитокини като TNF-α, IL-6 и IL-1β (Shoelson et al. 2006), докато инфилтрацията на провъзпалителни клетки в панкреатичните островчета може да допринесе за бета-клетъчна недостатъчност (Ehses et al. 2007). TNF-a, IL-6 и IL-1β са по-високи в серума на мишките със затлъстяване, отколкото в тези на контролните мишки. Обратно, силимаринът значително намалява нивата на TNF-α, IL-6 и IL-1β както на ниво иРНК, така и на протеин.

В заключение, когато затлъстяването се индуцира от HFD при мишки, едновременното лечение със силимарин подобрява чернодробната стеатоза, серумните нива на ALT/AST, инсулиновата резистентност и метаболизма на глюкозата чрез инхибиране на нивата на възпаление при мишки. В същото време лечението със силимарин намалява натрупването на мазнини при DIO мишки. Ние заключихме, че подобрението на силимарин при индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност може да зависи както от ефекта му върху облекчаването на възпалението, така и от смекчаването на мазнините. Следователно, силимаринът може би е мощна полезна билка за ежедневна профилактика на метаболитни синдроми. Освен това трябва да бъдат проверени подробният механизъм и целта за силимарин.

Декларация за оповестяване

Авторите не декларират конфликт на интереси.