Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

понижава

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

Отделение за вътрешни болести 1, Медицински факултет, Университет Оита, град Юфу, Оита, Япония

  • Коро Готох,
  • Мегуми Иноуе,
  • Кентаро Ширайши,
  • Takayuki Masaki,
  • Seiichi Chiba,
  • Кимихико Мицутоми,
  • Таканобу Шимасаки,
  • Хисае Андо,
  • Кансуке Фудживара,
  • Исао Кацураги

Фигури

Резюме

Цитат: Gotoh K, Inoue M, Shiraishi K, Masaki T, Chiba S, Mitsutomi K, et al. (2012) Интерленкин-10, получен от далак, понижава тежестта на предизвиканото от диета неалкохолно мастно заболяване на панкреаса, предизвикано от диета. PLoS ONE 7 (12): e53154. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053154

Редактор: Хуан Састре, Университет във Валенсия, Испания

Получено: 13 юни 2012 г .; Прието: 26 ноември 2012 г .; Публикувано: 28 декември 2012 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с безвъзмездна помощ за изследване на мерките за неразрешими болести от японското министерство на здравеопазването, труда и социалните грижи. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Далакът е най-големият лимфоиден орган в тялото и играе важна роля в имунната функция на гостоприемника. В едно проучване плъховете със затлъстяване показват намалена експресия на гени, кодиращи провъзпалителни цитокини като IL-6 и фактор на туморна некроза α (TNF-α) в далака [10]. За разлика от това, IL-10, който се синтезира от няколко клетъчни типа в множество органи, включително далака, инхибира синтеза на провъзпалителни цитокини. Нови доказателства сочат, че активираните В-клетки, които узряват в маргиналната зона на далака, произвеждат големи количества IL-10 и играят регулаторна роля за потискане на вредните имунни отговори [11]. Всъщност ниското производство на IL-10 е демонстрирано при затлъстяване [12], [13].

Въз основа на доказателствата в литературата, ние предполагаме, че затлъстяването потиска синтеза на IL-10 и по този начин води до хронично възпаление в панкреаса. Данните от настоящото проучване показват, че затлъстяването намалява експресията на IL-10 в далака и че IL-10, получен от далак, предпазва от възпалителни реакции, предизвикани от затлъстяването в панкреаса.

Изследователски дизайн и методи

Животни

Мъжки мишки C57Bl/6J (мишки от див тип, 22–25 g; KBT Oriental, Япония) и мишки с дефицит на IL-10 (мишки IL-10KO, 002251-B6.129P2-Il10 tm1Cgn/J, подарък от Sandy Morse, Лабораторията Джаксън, Бар Харбър, МЕ) бяха настанени в стая в университета в Оита при 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина със светлини от 07:00 до 19:00. Мишките IL-10KO, поддържани в нашия университет, бяха използвани за обратен кръстосване. Следните праймери на полимеразна верижна реакция (PCR) бяха използвани за генотипиране: 5′-CCACACGCGTCACCTTAATA-3 ′ (мутант напред), 5′-GTTATTGTCTTCCCGGCTGT-3 ′ (див тип) и 5′-CTTGCACTACCAAAGCCACA-3 ′ (често ). Всички проучвания са проведени в съответствие с насоките на университета в Оита, базирани на Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния институт по здравеопазване на САЩ. Освен това, това проучване е специално одобрено от комисията по етика на Отдела за лабораторни науки за животните, Проект за насърчаване на научните изследвания на университета в Оита.

Процедура за операция

Мишките се анестезират чрез интраперитонеално (i.p.) инжектиране на натриев пентобарбитал (100 mg/kg). За да се извърши спленектомия (SPX), коремната кухина беше отворена, двата основни източника на кръвен поток (артерия на далака и стомашна артерия) бяха обвързани с шевове близо до далака и лигирани и далакът беше внимателно отстранен [14]. SPX се извършва за 15 минути. За фиктивната операция коремът беше отворен, но далакът не беше отстранен. За всички хирургични процедури коремът беше затворен в един слой и 200 µl нормален физиологичен разтвор бяха приложени подкожно. В резултат на процедурата не са загинали мишки.

Експериментален протокол

Експеримент 1.

Мишки от див тип бяха разпределени в една от двете групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени със стандартна чау (Стандарт: 10% мазнини, 70% въглехидрати, 20% протеин; Diet Research, New Brunswick, NJ) в продължение на 8 седмици и след това се подлага на фалшива операция; мишки от група 2 са били хранени с високомаслена диета (СН: 60% мазнини, 20% въглехидрати, 20% протеини; Диетични изследвания) в продължение на 8 седмици и след това са били подложени на фалшива операция.

Експеримент 2.

Мишки от див тип бяха разпределени в една от двете групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени стандартно в продължение на 8 седмици и след това бяха подложени на фалшива операция; мишки от група 2 се хранят стандартно в продължение на 8 седмици и след това се подлагат на SPX.

Експеримент 3.

Мишки от див тип бяха разпределени в една от петте групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени стандартно в продължение на 8 седмици след фалшивата операция и им се прилагаше миши серумен албумин (m-албумин); мишки от група 2 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след фалшивата операция и след това им беше даден m-албумин; мишки от група 3 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след SPX и след това им беше даден m-албумин; мишки от група 4 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след SPX и след това им беше даден рекомбинантен миши IL-10 (r-IL-10, 0,5 ng/ден; Wako Chemicals, Осака, Япония); мишки от група 5 (група с двойно хранене) бяха хранени с количеството храна, консумирана от групата, лекувана със SPX, в продължение на 8 седмици след фалшивата операция и след това им беше даден m-албумин.

Експеримент 4.

Мишки от див тип и IL-10KO бяха разпределени в една от трите групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след фалшивата операция и им беше приложен m-албумин; мишки от група 2 се хранят с HF в продължение на 8 седмици след SPX и се прилагат m-албумин; и мишки от група 3 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след SPX и им беше приложен r-IL-10 (0,5 ng/ден; Wako Chemicals).

Осмотични помпи (Durect Corp., Купертино, Калифорния, САЩ), съдържащи m-албумин или r-IL-10, бяха имплантирани в гърбовете на всички мишки, успоредни на гръбначния стълб, в продължение на 4 седмици. Дозата на рекомбинантен миши IL-10 се определя чрез умножаване на средната нормална серумна концентрация на IL-10 (24 pg/ml) по средния общ обем на кръвта на 40 g мишка. Приемът на храна в продължение на 24 часа се изчислява чрез претегляне на останалата храна, а телесното тегло се определя между 17:00 и 18:00 всеки ден. Приемът на храна се нормализира според телесното тегло. Всички мишки бяха настанени за допълнителни 4 седмици след приключване на интервенциите. Всички мишки бяха анестезирани с натриев пентобарбитал и обезкървени след транскардиална перфузия със 100 ml физиологичен разтвор, съдържащ 200 единици хепарин. Далакът и панкреасът бяха отстранени и почистени, за да се отстранят перитонеалните мазнини и лимфните възли.

Нива на цитокини в далака, панкреаса и серума

За измерване на IL-1β, моноцитен хемотактичен протеин-1 (MCP-1) и нива на IL-10 в далака, панкреаса се използват търговски налични комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен тест (ELISA) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). и серум. Концентрацията на протеин във всеки орган се определя по метода на Лоури. Съотношенията IL-10/IL-1β също бяха изчислени.

Хистологични и имунохистохимични анализи

Пробите на панкреаса бяха фиксирани в 4% буфериран параформалдехид, вградени в парафин, разделени, депарафинизирани в ксилол и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) на Майер (Wako Chemicals), реагент Mallory-Azan за оценка на фиброза и с оцветяване в масло-червено-О до оценете разпределението на мазнините.

Фиброза на панкреаса

Секции на панкреаса бяха подложени на оцветяване Mallory-Azan. Средната фиброзна площ в 20 островчета на животно, идентифицирана като синьо оцветяване, беше оценена като процент от полето, използвайки Mac Scope версия 6.02. Хидроксипролин, маркер на общото съдържание на колаген в панкреаса, беше измерен с хидроксипролин ELISA комплект (USCN Life Science, Inc., Хюстън, Тексас, САЩ).

Съдържание на триглицериди на панкреаса (TG) и кръвна глюкоза и серумен инсулин на гладно, TG, свободна мастна киселина (FFA), общ холестерол (TC) и нива на лептин

След постигане през нощта, концентрациите на глюкоза в кръвта се измерват, използвайки метода на глюкозната оксидаза и глюкозен анализатор (MS-GR101; Terumo, Токио, Япония). Концентрациите на серумен инсулин и лептин се определят с помощта на комплекти ELISA за инсулин и лептин (Shibayagi, Gunma, Япония). Съдържанието на TG в пробите на панкреаса и серумните концентрации на TG, FFA и TC се определят с помощта на налични в търговската мрежа комплекти (Wako Chemicals).

Статистика

Резултатите бяха изразени като средна стойност ± SEM. Статистическите тестове включват двустранен t-тест на Student и двупосочен ANOVA, последван от тест на Scheffe за post hoc сравнение. За всички тестове нивото на значимост е определено на p Таблица 1. Ефекти на високочестотната диета върху нивата на далака и серума на про- и противовъзпалителните цитокини.

SPX причинява хипофагия, загуба на телесно тегло, повишаване на нивата на TG и FFA и намаляване на нивото на серумен адипонектин

Проучихме дали спленектомията допринася за възпаление в панкреаса. Първо изследвахме ефекта на спленектомията върху енергийния метаболизъм. SPX води до по-нисък енергиен прием, телесно тегло, тегло на епидидимална бяла мастна тъкан (WAT) и интересно по-ниски серумни нива на адипонектин в сравнение с фалшиви мишки (Таблица 2). Няма обаче съществени разлики в нивата на кръвната глюкоза на гладно и серумния инсулин между двете групи. В допълнение, SPX също води до повишени серумни нива на TG и FFA, но не и на TC, в сравнение с фалшивото лечение (Таблица 2).

SPX уголемява инсулино-положителната зона и ускорява фиброзата и натрупването на липиди

Оценени са ефектите на SPX върху оцветената с инсулин област, интра-островната и интра-лобуларната фиброза и натрупването на мазнини в панкреаса. SPX увеличи зоната, оцветена с инсулин и наруши архитектурата на островчетата и границите на островчетата в сравнение с фалшивото лечение (Фигура 1А и 1В). SPX също така влошава интра-островчетата (Фигура 1А и 1С) и интра-лобуларната фиброза (Фигура 1А и 1D), повишеното съдържание на хидроксипролин (Фигура 1Е) и процента на α-SMA-положителни клетки (Фигура 1А и 1F), повишен TG съдържание и натрупване на мазнини в панкреаса (Фигура 1А и 1G) и доведе до повишени нива на серумен лептин (Фигура 1Н) в сравнение с фалшиво лечение. Резултатите от H&E и оцветяването с маслено червено O показват, че SPX увеличава отлагането на мазнини главно в интра-лобуларните области, но не и в интраацинарните клетъчни области, докато малките вакуоли в ацинарните клетки са положителни за оцветяване в маслено червено O (Фигура 1А).

(A) Представителни изображения на оцветяване с инсулин (вляво), оцветяване на Mallory-Azan (в средата) и H&E оцветяване (вдясно) на участъци от панкреаса от мишки от всяка група. (B − E) Област на оцветяване с инсулин (Б.), вътреостровна фиброзна зона (° С), интра-лобуларна област на фиброза (д), съдържание на хидроксипролин (Е.), α-SMA-положителни клетки (F), Съдържание на TG (G) в панкреаса и нивото на серумния лептин (З.) във всяка група (n = 6). * P Фигура 2. Ефекти на SPX върху инфилтрацията на M1 и M2 макрофаги и върху възпалителните реакции в панкреаса.

(А и Б) Представителни изображения на оцветяване с CD11c (вляво) и оцветяване на CD206 (вдясно) в зоните вътре в островчетата (A) и интра-лобуларни области (Б.) в участъци на панкреаса от всяка група. (C − E) Процент на CD11c-положителна площ (° С) и CD206-положителна зона (д) и съотношение M1/​​M2 (Е.) в зоните на вътрешните островчета. (F − H) Процент на CD11c-положителна площ (F) и CD206-положителна зона (G) и съотношение M1/​​M2 (З.) в интра-лобуларни области. (J и K) Съдържание на про- и противовъзпалителни цитокини (J) и съотношение на интерлевкин (IL) -10/IL-1β (К) в панкреаса във всяка група (n = 6). * P Фигура 3. Системното приложение на IL-10 намалява предизвиканите от SPX промени в панкреатичните островчета.

(A) Представителни изображения на оцветяване с инсулин (вляво) и оцветяване на Mallory-Azan (вдясно) в участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (B-F) Област на оцветяване с инсулин (Б.), вътрешно-островни (° С) и интра-лобуларни (д) област на фиброза, съдържание на хидроксипролин (Е.) и α-SMA-положителни клетки (F) в панкреаса във всяка група (n = 6). * P # P Фигура 4. Системното приложение на IL-10 намалява SPX-индуцираното натрупване на мазнини, инфилтрацията на макрофаги и провъзпалителните реакции в островчетата.

(A) Представителни изображения на CD11c оцветяване (горни секции) и CD206 оцветяване (долни секции) във вътрешно-островни области в участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (B-D) CD11c-положителни области (Б.), CD206-положителни области (° С) и съотношения M1/​​M2 (д) в островчетата във всяка група (n = 6). * P # P # P # P $ P Фигура 5. Системното приложение на IL-10 намалява SPX-индуцираното натрупване на мазнини, инфилтрацията на макрофаги и противовъзпалителните реакции в панкреаса.

(A) Представителни изображения на H&E оцветяване, масленочервено O оцветяване, оцветяване CD11c и оцветяване CD206 във вътрешно-лобуларните области в участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (B − E) TG съдържание (Б.), Съотношения M1/​​M2 (° С), съдържание на про- и противовъзпалителни цитокини (д) и съотношения IL-10/IL-1β (Е.) в панкреаса на всяка група (n = 6). * P # P Фигура 6. SPX има малък ефект върху промените в панкреатичните островчета при мишки с дефицит на IL-10.

(A) Представителни изображения на оцветяване с инсулин (вляво), оцветяване на Mallory-Azan (в средата) и оцветяване на α-SMA (вдясно) в участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (B-F) Област на оцветяване на инсулин в панкреаса (Б.), вътреостровна фиброзна зона (° С) и интра-лобуларна област на фиброза (д), съдържание на хидроксипролин (Е.) и α-SMA-положителни клетки (F) във всяка група (n = 6). * P # P Фигура 7. SPX има малък ефект върху натрупването на мазнини в панкреаса при мишки с дефицит на IL-10.

(A и Б.) Представително H&E оцветяване (A) и маслено червено O оцветяване (Б.) във вътрешно-лобуларни области в участъци на панкреаса от всяка група. Мащабна лента = 150 µm. (° С и д) Съдържание на TG на панкреаса (° С) и ниво на серумен лептин (д) във всяка група (n = 6). * P # P Фигура 8. SPX има малък ефект върху инфилтрацията на макрофаги в островчета на мишки с дефицит на IL-10.

(А и Б) Представителни изображения на оцветяване на CD11c (A) и CD206 оцветяване (Б.) във вътрешно-островни области на участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (C − E) CD11c-положителни области (° С), CD206-положителни области (д) и съотношения M1/​​M2 (Е.) в островчетата във всяка група (n = 6). * P # P Фигура 9. SPX има малък ефект върху инфилтрацията на макрофаги в интра-лобуларната област на мишки с дефицит на IL-10.

(А и Б) Представителни изображения на оцветяване на CD11c (A) и CD206 оцветяване (Б.) във вътрешно-лобуларни области в участъци на панкреаса от всяка група. Скала = 100 µm. (C − E) CD11c-положителни области (° С), CD206-положителни области (д) и съотношения M1/​​M2 (Е.) във вътрешно-лобуларни области във всяка група (n = 6). * P # P Фигура 10. SPX има малък ефект върху провъзпалителните цитокини в панкреаса на мишки с дефицит на IL-10.