Допринесе еднакво за тази работа с: Xueping Li, Yada Treesukosol

свръхекспресиращите

Настоящ адрес: Медицински колеж Сиан, Сиан, Китай

Отдел за фармацевтични науки на Университета на Мериленд, Училище по фармация, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Допринесе еднакво за тази работа с: Xueping Li, Yada Treesukosol

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отдел за фармацевтични науки на Университета на Мериленд, Училище по фармация, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отдел за фармацевтични науки на Университета на Мериленд, Училище по фармация, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета Джон Хопкинс, Медицински факултет, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия към Университета "Джон Хопкинс", Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Отдел за фармацевтични науки към Университета на Мериленд, Училище по фармация, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

  • Сюпинг Ли,
  • Яда Треесукосол,
  • Александър Могадам,
  • Меган Смит,
  • Ерика Офелд,
  • Dejun Yang,
  • Tianxia Li,
  • Кели Тамаширо,
  • Пике Чой,
  • Тимъти Х. Моран

Фигури

Резюме

Цитат: Li X, Treesukosol Y, Moghadam A, Smith M, Ofeldt E, Yang D, et al. (2014) Поведенческа характеристика на свръхекспресиращите мишки на Hyperphagia Synphilin-1. PLoS ONE 9 (5): e91449. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091449

Редактор: Силвана Гаетани, Университет Сапиенца в Рим, Италия

Получено: 24 октомври 2013 г .; Прието: 12 февруари 2014 г .; Публикувано: 14 май 2014 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националния здравен институт безвъзмездна помощ DK083410 на Wanli W. Smith. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Wanli W. Smith служи като академичен редактор в редакционния съвет на PLOS ONE и заяви, че това не променя придържането на авторите към редакционните политики и критерии на PLOS ONE. Останалите съавтори са декларирали, че не съществуват конкурентни интереси.

Въведение

Синфилин-1 (919 аа) е клетъчен протеин, преобладаващо експресиран в цитозола [1]. Протеинът синфилин-1 присъства в много тъкани с обогатена експресия в неврони [1]. Съобщава се, че синфилин-1 взаимодейства с редица протеини, включително алфа-синуклеин, паркин и други протеазомни/убиквитинови протеини [1] - [5]. Предишни доклади показаха, че синфилин-1 засилва образуването на вътреклетъчни протеинови включвания и може да участва в патогенезата на болестта на Паркинсон (PD) [1] - [4], [6]. Синфилин-1 може да намали свързаната с PD мутантна алфа-синуклеин-, ротенон- и 6-HODA-индуцирана токсичност in vitro и забавя алфа-синуклеинопатиите в PD миши модел in vivo [7], [8]. Неотдавнашни проучвания на човешки синфилин-1 трансгенни модели на дрозофила и мишки разкриха, че свръхекспресията на човешки синфилин-1 води до увеличаване на приема на храна, телесно тегло и отлагане на мазнини, наподобяващи ключови характеристики на човешкото затлъстяване [9], [10]. Докато тези проучвания предполагат роля на синфилин-1 в регулирането на енергийния баланс, биологичните механизми, лежащи в основата на медиираната от синфилин-1 хиперфагия и затлъстяване, са неизвестни.

Хиперфагията е основна характеристика на много модели на затлъстяване и промените в множество сигнални пътища могат да допринесат за хиперфагия [11] - [17]. По този начин, подробният анализ на промените в приема на храна в модела на SP1 мишка може да даде представа за основните механизми, които задвижват хиперфагията [9]. Повишеният прием на храна може да бъде резултат от увеличения размер на храненето, броя на храненията или и двете [11] - [17]. Директният контрол върху размера на храненето може да бъде категоризиран в положителни и отрицателни сигнали, които поддържат и прекратяват хранителното поведение съответно [18]. Положителната обратна връзка се получава чрез стимулиране на вкусовите, обонятелните и соматосензорните рецептори в устната кухина, докато отрицателната обратна връзка се получава при контакт с рецептори в устната кухина, стомаха и тънките черва [19], [20]. Повишената оросензорна стимулация и/или намалената чувствителност към постингестивни инхибиторни сигнали би променила режима на хранене, което води до увеличаване на приема на храна.

В настоящите проучвания тествахме отделни кохорти на 6–8-седмични („пред-затлъстели“) и 4-месечни („затлъстели“) мъжки мишки SP1 и контролни NTg, съобразени с възрастта, за да оценим 1) как начин на хранене параметрите се променят, за да отразят увеличения прием на храна при SP1 мишки, 2) дали експресията на синфилин-1 променя апетитното поведение или безусловните реакции на близане към захарозата, които се различават от тези на контролните мишки NTg, и 3) има ли промени в поведението при хранене, свързани с хиперфагия и затлъстяване. Резултатите от тези поведенчески оценки биха осигурили по-добро разбиране за това как експресията на синфилин-1 води до хиперфагия и затлъстяване.

Материали и методи

Субекти

Мишките SP1, които експресират човешки синфилин-1 в неврони под миши прионов протеинов промотор, се генерират, както е описано по-горе [9]. SP1 мишки за поведенчески експерименти са генерирани чрез последователно обратно кръстосване със щама C57BL6. На 3-седмична възраст SP1 мишките и контролите, съответстващи на възрастта (NTg) бяха отбити. След това беше извършено PCR-генотипиране за разделяне на нетрансгенни и SP1 мишки, както е описано по-горе [7]. Накратко, 1 cm върх на опашката на всяка мишка беше отрязан и подложен на ДНК екстракция. След това получената ДНК се подлага на PCR, използвайки праймери за откриване на последователностите на синфилин-1. Мъжки мишки NTg и SP1 на 6–10 седмици („преди затлъстяване“) и 4 месеца („затлъстяване“) са използвани като субекти в описаните поведенчески процедури. Всички експерименти с животни са одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета Джон Хопкинс.

Анализ на Western Blot

Мозъците на контролните мишки Synphilin-1 и NTg се хомогенизират, както е описано по-горе [9]. Мозъчните хомогенати бяха подложени на Western blot анализ, използвайки анти-синфилин-1 антитела, както е описано по-рано [9].

Анализ на модела на хранене

Мишките за сравнения „преди затлъстяването“ (n = 9–10/група) бяха настанени единично в клетките за наблюдение на приема на храна DietMax System (AccuScan Instruments, Inc., Columbus, OH) (дължина 32 см, ширина 22 см) с ad libitum достъп до прахообразна чау (6% мазнини, 3,1 kcal/g; 2018 Tekland, Harlan) и вода. Приемът на храна се наблюдава непрекъснато в продължение на 23-часови сесии на ден, както е описано по-рано [21]. Прахообразната лабораторна чау-диета се осигурява ad libitum в буркан с храна, поставен върху кантар в отделението за хранене на клетката. Животните имаха достъп до буркан с храна през отвор в стената на клетката. На съседна стена на клетката беше монтирана бутилка с вода. Водата се предлагаше ad libitum.

Тестването започна след 7 дни привикване към експерименталната среда и поддържане на диета с чау. В продължение на три последователни дни бяха взети мерки за хранене на прахообразна чау. За мишките на възраст 4–6 седмици се измерва приемът на прахообразна диета с високо съдържание на мазнини (45% мазнини, 4,73 kcal/g; D12451, Изследователски диети) през следващите 3 последователни дни Оперативно се определя пристъп за хранене, изискващ ≥ 0,02 g храна. Интервал от ≥10 минути без прием на храна определя прекратяването на храненето. Критериите за този двубой представляват средно 90% от данните за храненето в настоящото проучване. Една мишка произвежда прекомерно разливане на стандартната чау, поради което данните от това животно са изключени за анализ на данните.

За сравненията със „затлъстяване“ (n = 6–7/група), мишките бяха настанени единично при подобни условия на изпитване, но в тестови клетки (Coulbourn Instruments, Allentown PA) (19 cm × 19 cm), снабдени с дозатор за пелети, който доставя 20 mg пелети от чау (3,8% мазнини, 3,35 kcal/g; Bioserve), както е описано по-рано [22]. Изваждането на пелета от съда за хранене активира дозатора на пелети, за да достави друга пелета. Параметрите на схемата на хранене бяха измерени през четири последователни дни. Храната беше дефинирана оперативно като най-малко 3 пелети, предшествани и последвани от поне 10 минути без прием на храна.

Процедура за кратък достъп до вкуса

Тази оценка на поведението е извършена, както е описано по-рано с леко изменение [23]. Допълнителни кохорти от мъжки мишки на 6–10 седмици (n = 8/група) или на 4-месечна възраст (n = 8/група) бяха настанени индивидуално в процедурна стая, където влажност, температура и 12 часа светлина-12 часа тъмно цикъл се контролираха автоматично. Поведенческите тестове започнаха след поне 3 дни адаптация към стаята за експериментални процедури. По време на поведенческо обучение мишките са били на график за ограничаване на водата. Водата е отвеждана от домашните клетки за 23 часа преди тестването. Животните имаха достъп до вода само по време на тренировките. След последната тренировка животните получиха свободен достъп до вода в домашните клетки. След това мишките бяха тествани с различни концентрации на захароза при условие на частично ограничаване на храната и водата, при което им бяха представени ~ 1 g чау и ~ 2 ml вода за ~ 23 часа преди тестването. Най-малко един ден за презареждане (свободен достъп до вода и чау) следва всеки ден за изпитване при ограничения за храна и вода.

Обучението и тестването бяха извършени в ликометър (Davis MS-160, DiLog Instruments, Tallahassee FL) по време на светлинния цикъл, както е описано по-рано [23], [24]. Животното беше поставено в тестовата камера и имаше достъп до един чучур, разположен на около 5 мм зад процепа. Потенциално изпитание беше направено с отварянето на капака, излагащ чучура за пиене. Мишката облиза чучура, за да започне проба. Затворът се затваря след всяко изпитание (5 s). По време на всеки интервален интервал (8 s) представянето на тръбата се променя от моторизиран блок и след това затворът се отваря отново за следващото изпитание. На животните беше позволено да инициират възможно най-много опити по време на 25-минутни сесии. Концентрациите бяха представени в рандомизирани блокове от 7. Избрани са вода и шест концентрации захароза (0,03, 0,06, 0,15, 0,3, 0,6 и 1,0 М), които покриват динамичния диапазон на реакция на мишките. Всички разтвори се приготвят ежедневно с използване на дестилирана вода.

Животните бяха подложени на ~ 23 часа график за ограничаване на водата за четирите дни на поведенчески тренировки, по време на които животните имаха свободен достъп до вода само по време на ежедневните сесии. На 1 и 2 ден на животните беше разрешен достъп до неподвижен чучур за вода за 30-минутни сесии. На 3 и 4 ден на животните беше разрешен достъп до седем чучура с вода в 5-те опити в рамките на 25-минутни сесии. След края на сесия 4, животните получиха свободен достъп до вода в домашните си клетки. Следващата седмица животните бяха подложени на тестове с вода и шест концентрации захароза в рамките на три 25-минутни дневни сесии при условие на частично ограничаване на водата и храната с един презареждащ се ден, разпръснат между тестовите дни.

Резултати

Средният размер на храненето се увеличава при SP1 мишки

Кохортите както на затлъстели (на възраст 6-10 седмици), така и на затлъстели (на възраст 4 месеца) SP1 трансгенни мишки са генерирани, както е описано по-горе [9]. Човешки протеини синфилин-1 се експресират в мозъка както на етапи преди затлъстяване, така и на затлъстяване, както се определя чрез Western blot анализ с използване на антитела срещу човешки синфилин-1 (Фигура 1).

Мозъчните хомогенати от SP1 и нетрансгенни контролни мишки бяха подложени на Western blot анализ, използвайки анти-синфилин-1 и анти-актинови антитела.

По време на периода преди затлъстяването няма значителна групова разлика в телесното тегло между мишките SP1 и NTg. Въпреки това, SP1 мишките консумират значително по-стандартна чау, отколкото контролните мишки. Оценката на модела на хранене показа, че има тенденция за увеличаване на размера на храненето (Фигура 2Б) и леко намаляване на броя на храненията (Фигура 2C), въпреки че тези данни не достигат статистически разлики нито в размера на храненето, нито в броя на храненията .

Среден (A) дневен прием, (B) размер на храната и (C) брой на хранене за стандартен чау и (D) прием, (E) размер на хранене и (F) брой на хранене за диета с високо съдържание на мазнини за NTg (черни ленти) синфилин -1 мишки (бели ленти) в точката на времето „преди затлъстяването“. * p Фигура 3. Схема на хранене на SP1 затлъстели мишки.

А. телесно тегло. Среден (B) дневен прием, (C) размер на хранене и (D) брой на хранене за стандартна чау за NTg (черни стълбове) мишки синфилин-1 (бели стълбове) в момент на затлъстяване. * Фигура 4. Телесно тегло на пред-затлъстели и затлъстели SP1 мишки.

Както е посочено, телесното тегло на мишките е измерено по време на тестовите дни в тестовете за кратък достъп до вкус. NTg (черни символи) и синфилин-1 мишки (бели символи). * p Фигура 5. Отговор на лизане към захароза при SP1 пред-затлъстели мишки.

Средни (A) общи облиза и (B) стойности на интервалите на интерлик до неподвижен чучур вода. (C) Лиже по отношение на вода през масив от концентрация на захароза и (D) брой опити, започнати за NTg (черни символи) и синфилин-1 (бели символи) мишки в момент на „затлъстяване“. * p Фигура 6. Отговор на близане към захароза на SP1 затлъстели мишки.